【摘 要】
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苜蓿作为牧草之王,在奶牛泌乳方面起着重要作用。在动物体内可检测出外源性植物miRNA,并调控动物生理功能,因此苜蓿中的miRNA（mtr-miRNA）也可能被动物消化吸收后靶向特定基因来影响奶牛泌乳。本试验筛选出牛血清和乳清中差异表达的mtr-miR-162,探析mtr-miR-162对奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳蛋白合成的影响,从分子和细胞水平研究mtr-miR-162对奶牛乳腺上皮细胞的作用机制,
【基金项目】
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国家自然科学基金（31960680）； 宁夏重点研发项目引才专项（2018BEB04031）； 宁夏自然科学基金优秀青年项目（2022AAC05012）；
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苜蓿作为牧草之王,在奶牛泌乳方面起着重要作用。在动物体内可检测出外源性植物miRNA,并调控动物生理功能,因此苜蓿中的miRNA（mtr-miRNA）也可能被动物消化吸收后靶向特定基因来影响奶牛泌乳。本试验筛选出牛血清和乳清中差异表达的mtr-miR-162,探析mtr-miR-162对奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳蛋白合成的影响,从分子和细胞水平研究mtr-miR-162对奶牛乳腺上皮细胞的作用机制,以期为生产上应用苜蓿源miRNA提高乳蛋白提供新的理论依据。主要研究结果如下:（1）荷斯坦奶牛血清和乳清中苜蓿源miR-162的筛选从苜蓿miRNA组学测序结果中筛选出高丰度miRNAs,并在奶牛血清和乳清中检测苜蓿miRNAs的表达,使用高碘酸钠氧化验证外源性miRNAs并结合苜蓿miRNAs中G、C含量,选择miRNA进行后续试验。结果表明,组学筛选出的mtr-miR-162、mtr-miR-2643a和mtr-miR-396a在牛血清和乳清中的低乳蛋白率组显著高于高蛋白率组（P＜0.05）;mtr-miR-162、bta-miR-16a和bta-miR-25在高碘酸钠氧化后表达量分别下调了 75%、95%和95%,mtr-miR-162较其它两个苜蓿miRNAs的G、C含量（48%）最高,由于高G、C具有抵抗高碘酸钠氧化的能力,因此选择mtr-miR-162进行后续试验。（2）mtr-miR-162 可特异性靶向 GNG11 的 3’ UTR使用TargetScan和RNAhybrid预测并筛选mtr-miR-162与乳蛋白合成相关基因,并采用双荧光素酶报告基因试验进行靶向关系验证。结果表明,在乳蛋白合成相关通路中共筛选出6个基因,其中3个基因与乳蛋白合成相关;共转染mtr-miR-162 mimic和psiCHECK-GNG1 1-wt,与mimics NC组相比,其荧光素酶活性显著降低（P＜0.001）;共转染mtr-miR-162 mimic和psiCHECK-GNG11-mut与mimics NC组相比,荧光素酶活性差异不显著（P＞0.05）。说明,在奶牛乳腺上皮细胞中mtr-miR-162可特异性靶向GNG11的3’ UTR。（3）mtr-miR-162可影响奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳蛋白合成相关基因表达使用CCK-8和qRT-PCR检测过表达mtr-miR-162对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响,结果表明过表达mtr-miR-162抑制乳腺上皮细胞增殖活力,且CDK4、CyclinD1和PCNA表达量均显著降低（P＜0.05）;过表达 mtr-miR-162 显著下调 GNG11、PIK3R6、AKT1、mTOR、RPS6、eIF4E、RHEB、eIF4B、S6K1 和 CSN2 表达量（P＜0.05）,显著上调 4EBP1 和 CSN3 表达量（P＜0.05）。因此,mtr-miR-162在mRNA水平上通过靶向GNG11来调控乳腺上皮细胞增殖和乳蛋白合成,且抑制编码β-酪蛋白CSN2的表达和促进编码κ-酪蛋白CSN3的表达。
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