【摘 要】
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随着我国社会经济水平的不断提高和发展,人口压力与日俱增,人们对于淡水鱼类的需求也日益增多。需求量的增大使得精养鱼池集约化养殖规模加大,养殖密度不断增加,也因此鱼类病害频繁爆发。为了防止鱼类病害的频繁发生,抗生素被大量使用,使得水产养殖生态环境遭到破坏,鱼类健康养殖受到更加广泛的威胁。目前对大部分鱼类病原致病机理的研究还不够深入,同时还迫切需要发现更安全环保且有效的鱼类病害防治措施。香鱼假单胞菌(P
【基金项目】
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湖南省科技重大专项(2017NK1030); 湖南省重点项目(2016NK2129); 大北农公司重点实验室开放课题:鱼类主要细菌性病病原菌的拮抗菌筛选及其制剂研制与应用(FACE20200002); 国家自然科学基金(31770106); ;国家
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随着我国社会经济水平的不断提高和发展,人口压力与日俱增,人们对于淡水鱼类的需求也日益增多。需求量的增大使得精养鱼池集约化养殖规模加大,养殖密度不断增加,也因此鱼类病害频繁爆发。为了防止鱼类病害的频繁发生,抗生素被大量使用,使得水产养殖生态环境遭到破坏,鱼类健康养殖受到更加广泛的威胁。目前对大部分鱼类病原致病机理的研究还不够深入,同时还迫切需要发现更安全环保且有效的鱼类病害防治措施。香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)常引起多种水生鱼类患“内脏白点病”,造成鱼类大量死亡,因此,研究鱼源致病性香鱼假单胞菌的致病机理和防控方法对发展鱼类健康养殖有着重要的科学参考价值和应用价值。本研究从长沙望城鱼池基地的患病鲫鱼肠道中筛选得到一株优势病原菌菌株,经鉴定该菌株为假单胞菌属中的香鱼假单胞菌(P.plecoglossicida),筛选出的菌株为香鱼假单胞菌种中的新菌株,将其命名为:P.plecoglossicida LQJ06。该菌株对斑马鱼的半致死浓度LD50为2.98×106cfu/尾,表现为较强毒力。用红色荧光蛋白标记LQJ06菌株后观察其在斑马鱼体内的动态分布,结果显示LQJ06菌株主要定殖于斑马鱼肠道,组织切片病理结构分析显示LQJ06菌株对肠道破坏严重,肠道组织上皮细胞出现坏死,肠绒毛发生脱落,肝脏细胞细胞核发生固缩偏移,细胞空泡化,脾脏中淋巴细胞增生。香鱼假单胞菌LQJ06菌株能够入侵草鱼肝脏细胞L8824并在细胞中增殖,但入侵细胞期间,出现过细菌数目减少的情况,推测LQJ06菌株入侵草鱼肝脏细胞L8824时诱发了细胞短暂的应激反应,使细胞内化的病原菌数目降低。用Hoechst和PI双染方法,检测到这种应激反应可能是L8824细胞发生了凋亡。随后内化细菌克服草鱼肝脏细胞L8824的应激反应,数量逐渐增加,实现在细胞中的增殖。LQJ06菌株培养上清液对细胞的毒性作用会导致细胞形态发生改变。主要表现为细胞聚集,细胞固缩,生长缓慢甚至死亡。本研究中在制备的香鱼假单胞菌LQJ06菌株灭活疫苗处理草鱼肝脏细胞的试验中,结果显示疫苗安全无毒。斑马鱼采用不同的免疫方式接种灭活疫苗,观察疫苗对斑马鱼的保护效果。相比于口服免疫组,注射免疫组中大部分细胞免疫因子更早表达且表达量较高。肠道和肝脏组织中分别主要表达IFNγ-2和IL-1β,这些免疫相关因子的上调表明疫苗能够增强斑马鱼的免疫力,诱发炎症,抵御病原感染。同源病原攻毒斑马鱼时注射免疫组的保护率达到66%,口服免疫组保护率为46.6%,注射接种对斑马鱼的保护率更高,表明通过注射的方式能够达到最好的保护效果。以上试验结果为进一步防控鱼类病原香鱼假单胞菌的研究提供了科学依据,为研制香鱼假单胞菌灭活疫苗提供了重要前期基础。
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