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目的:1.额尔敦乌日勒提取物对神经细胞保护作用及相关基因的表达的研究。2.额尔敦乌日勒促进神经细胞突起生长及相关基因表达的研究。方法:1.药物提取及成分分析;将额尔敦乌日勒磨成粉取五份0.5 g,分别用蒸馏水、无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚等五种溶剂浸泡12 h,继续在37℃、210 rpm/min加热回馏8 h,过滤、旋转蒸馏、氮气吹干、称重、乙腈溶解,利用UPLC-QTOF-MS分析额尔敦乌日勒的神经相关的成分。2.MTT检测法:将在-196℃液氮中保存的PC12细胞复苏传代3-5次生长稳定后接种于96孔板内(1×104个/孔),在37℃、含5%CO2的培养箱中孵育24 h之后,弃去原有的培养液换成加入样品的新鲜培养液,在培养箱中孵育24 h。不弃培养液每孔加50μl的1×MTT溶液,继续孵育4 h,将原液弃去,再每孔分别加入100μl DMSO,震荡、使结晶物充分溶解,用酶标仪在450 nm波长处检测每孔的吸光值。根据检测结果,选用五种溶剂提取的额尔敦乌日勒的50μg/m L和100μg/m L两种浓度。3.额尔敦乌日勒提取物对神经细胞保护作用:神经保护作用结果实验组分为对照空白组(NT)、H2O2组、对照组、蒙药组(五种溶剂提取的额尔敦乌日勒)等四组。3.1 MTT检测法:将用H2O2诱导的PC-12细胞上加入对照样品Quercetin(50μg/m L、80μg/m L)和样品(50μg/m L、100μg/m L)用酶标仪在450 nm波长处检测每孔的吸光值。通过计算细胞活率,验证对神经细胞的保护作用。3.2抗氧化作用;通过检测活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)来验证抗氧化作用。3.3活/死细胞双染法:H2O2诱导的PC12细胞上加五种溶剂提取的额尔敦乌日勒后PC12细胞的活死情况验证对神经细胞的保护作用。红色为死细胞、绿色为活细胞。3.4 RT-q PCR检测:检测与神经凋亡相关基因(Bax、NF-k B、Caspase9、Bcl-2、PARP、p38、Jnk、Akt等)的表达水平。4.额尔敦乌日勒提取物促进神经细胞突起生长作用研究4.1五种溶剂提取的额尔敦乌日勒促进神经细胞突起生长作用:每个实验组取三个复孔,每个孔随机3个视野,且每个视野不重叠,采用Image J软件测量每个视野中神经突起的长度。4.2 RT-q PCR检测:检测与促进神经突起相关基因(Nefh、Sym1、Dlg4等)表达水平。结果:1.UPLC-QTOF-MS分析结果:从额尔敦乌日勒成分中检测出16种与神经相关的成分。2.细胞毒性—MTT法检测结果:蒸馏水提取的额尔敦乌日勒在150μg/m L、200μg/m L时稍有毒性。无水乙醇提取的额尔敦乌日勒在150μg/m L时开始有毒性。正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取的额尔敦乌日勒也都在150μg/m L时开始有毒性,石油醚提取的额尔敦乌日勒比其他几个毒性较大。根据此结果,选用五种溶剂提取的额尔敦乌日勒的50μg/m L和100μg/m L两种浓度。3.额尔敦乌日勒提取物对神经细胞保护作用3.1 MTT法检测结果:H2O2组与NT相比细胞活率降低了60%,对照组与蒙药组明显提高细胞活率。3.2抗氧化检测结果:(1)活性氧(ROS)含量测定:H2O2组与NT相比细胞ROS含量明显上升,对照组和蒙药组与H2O2组相比将细胞ROS含量明显降低。(2)超氧化物歧化酶(SOD)活力:H2O2组与NT相比细胞SOD活力量明显下降,对照组和蒙药组与H2O2组相比将细胞SOD活力明显提高。过氧化氢酶(CAT)活力:氧化H2O2组与NT相比细胞CAT活力量明显下降,对照组和蒙药组与H2O2组相比将细胞CAT活力明显提高。影响ROS含量、SOD活力、CAT活力,石油醚提取的额尔敦乌日勒最显著。3.3活/死细胞双染结果:H2O2组与NT相比红色细胞明显增多,对照组和蒙药组与H2O2组相比将死细胞量明显降低。3.4 RT-q PCR检测结果:与H2O2组相比蒙药组的Bax、NF-k B、Caspase9、Bcl-2、PARP、p38、Jnk、Akt的表达显著,石油醚提取的额尔敦乌日勒及其显著。4.额尔敦乌日勒提取物促进神经细胞突起生长结果4.1细胞形态变化结果:与NT相比对照组和蒙药组明显促进细胞突起长度,蒙药组的蒸馏水提取的额尔敦乌日勒及其显著。4.2 RT-q PCR检测结果:与NT相比对照组和蒙药组的Nefh、Sym1、Dlg4的表达显著。结论:1.额尔敦乌日勒成分中检测出16种与神经相关的成分。2.额尔敦乌日勒提取物有神经细胞保护作用。用石油醚提取的额尔敦乌日勒最显著。3.额尔敦乌日勒促进神经细胞突起生长。用蒸馏水提取的额尔敦乌日勒最显著。