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研究背景肺癌是我国第一大癌症,寻找新的高效低毒抗肺癌药物具有重大意义。天然生物碱是抗肿瘤药物的重要来源,本课题前期针对天然生物碱进行了大量的筛选工作,发现毛钩藤碱（Hirsutine）具有良好的体内外抗肺癌活性,对正常细胞毒性小,具有开发成为高效低毒的抗肺癌新药潜力。毛钩藤碱（Hirsutine）是茜草科藤本植物钩藤（Uncaria rhynchophylla）中的生物碱类活性成分之一,已有报道,Hirsutine具有保护缺氧诱导的心肌损伤,保护炎症介导的神经损伤的作用,在抗肿瘤领域亦有报道,Hirsutine可抑制乳腺癌细胞的转移和侵袭,诱导乳腺癌细胞DNA损伤,提示Hirsutine具有抗肿瘤活性。但Hirsutine抗肺癌作用及分子机制尚不明确。因此,本课题拟进一步明确Hirsutine是否具有选择性抗肺癌作用,并阐明其具体作用机制。一、Hirsutine选择性诱导肺癌细胞凋亡CCK8法和流式细胞术检测发现Hirsutine可诱导肺癌A549和NCI-H1299细胞凋亡增加,呈现良好的量效和时效关系,Western blot检测发现Hirsutine可诱导凋亡相关蛋白C-PARP和C-Caspase 3表达增加。但Hirsutine对人正常肝细胞LO2、人正常胚肺细胞WI-38几乎没有毒性。提示Hirsutine可能具有高效、低毒的抗肺癌效应。二、Hirsutine诱导肺癌细胞线粒体损伤电镜观察到Hirsutine作用后线粒体呈现空泡化、肿胀和内嵴紊乱,提示Hirsutine可能诱导了线粒体损伤。JC-1染色显示Hirsutine可显著下调线粒体膜电位且具有良好量效关系。荧光素酶法ATP检测试剂盒检测到Hirsutine可显著下调ATP的产生。DCFH-DA染色法流式检测发现Hirsutine可诱导细胞ROS产生增加。Western blot检测Cyto C从线粒体释放到胞浆增加。Calcein-AM/CoCl2染色法发现Hirsutine可诱导线粒体渗透性转换孔（MPTP）开放,免疫沉淀和MPTP开放抑制剂Cyclosporin A的应用确认Hirsutine诱导了环亲和素D（cyclophilinD,CypD）和腺苷酸转运体（adenine nucleotide translocase 1,ANT1）直接结合,从而促使MPTP孔开放,导致线粒体损伤途径细胞凋亡。三、Hirsutine通过ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β通路诱导肺癌细胞凋亡1、为了进一步阐明Hirsutine诱导肺癌细胞线粒体损伤的机制,采用Western blot法检测到Hirsutine诱导GSK3β（S9）去磷酸化,呈现良好的量效和时效关系。应用GSK3β（S9）小分子抑制剂CHIR99021进一步确认Hirsutine诱导的CypD和ANT1结合介导的MPTP开放依赖于GSK3β（S9）去磷酸化。2、由于GSK3β（S9）是PI3K/Akt通路重要的下游靶点,采用Western Blot法检测PI3K、Akt蛋白表达情况,发现Hirsutine可显著去磷酸化抑制PI3K/Akt活性,并呈现良好的量效和时效关系。采用PI3K抑制剂LY294002发现LY294002可进一步加剧Hirsutine诱导的GSK3β（S9）去磷酸化;LY294002可进一步降低Hirsutine诱导的p-GSK3β（S9）与ANT1直接结合,增加ANT1和CypD结合介导的MPTP开放,增加细胞凋亡。3、进一步研究发现,Hirsutine可诱导ROCK1降解激活、PTEN磷酸化,采用ROCK1抑制剂Y-27632和慢病毒基因敲降ROCK1均可阻断Hirsutine诱导的PTEN磷酸化、PI3K/Akt/GSK3β去磷酸化;Y-27632或稳定敲降ROCK1均可逆转Hirsutine诱导的p-GSK3β（S9）与ANT1结合降低;Y-27632或稳定敲降ROCK1均可阻断Hirsutine诱导的CypD与ANT1直接结合,并进一步阻断MPTP开放,逆转ATP产生减少和细胞凋亡。表明Hirsutine诱导的PI3K/Akt抑制和MPTP开放依赖于ROCK1/PTEN途径的激活。四、肺癌裸鼠异种移植瘤模型证实Hirsutine具有良好的抗肺癌作用,并通过激活了ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β通路1、采用肺癌A549细胞株构建裸鼠移植瘤模型。随机将裸鼠分为Hirsutine处理组和无菌盐水对照组,定期测量裸鼠生长体重和瘤体体积,每日观察裸鼠状态。结果发现,与对照组相比,Hirsutine可显著抑制裸鼠移植瘤的生长,两组体重无显著差异,肝肾HE染色结果提示Hirsutine对裸鼠无明显肝肾毒性,提示Hirsutine在一定剂量和作用时间下具有高效低毒的体内抗肺癌效应。2、为验证ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路在Hirsutine诱导的体内抗肺癌效应中的重要作用,采用免疫组化法和Western blot法检测了ROCK1、P-PTEN、P-PI3K、p-Akt及p-GSK3β（S9）的表达,免疫组化染色发现:Hirsutine处理组C-Caspase 3表达增加,p-GSK3β（S9）减少。Western blot检测发现:Hirsutine处理可降解激活移植瘤中ROCK1,增加PTEN磷酸化,降低p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β（S9）的表达。表明Hirsutine体内水平诱导的A549细胞凋亡通过激活ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路。本文主要结论如下:Hirsutine可选择性诱导多种肺癌细胞凋亡,并可有效抑制肺癌裸鼠移植瘤生长,具有较强的体内外抗肺癌效应。机制研究发现Hirsutine的抗肺癌作用依赖于ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路的激活,进而引起MPTP开放介导的线粒体损伤,最终导致Caspase激活和细胞凋亡。本研究明确了Hirsutine的体内外抗肺癌作用,阐明了Hirsutine抗肺癌的具体分子机制,为开发Hirsutine成为高效低毒的抗肺癌药物和ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路分子成为新的肿瘤治疗靶点提供实验依据。