昆虫作为地球上数量最多、种类丰富的一个生物类群,飞行能力的获得为其在地球上的大范围扩散奠定了基础。为了进一步适应地球复杂的生存环境,不同昆虫衍生出了形态各异的翅膀,且同物种间前后翅形态也存在较大的差异。近年来,随着进化发育生物学研究策略的不断革新,已经明确昆虫翅的起源、发生及发育与同源异型基因（Homeotic gene,Hox）紧密相连。Hox基因是1978年由路易斯在果蝇中首次发现的,是控制动物从前到后各个体节形态的重要发育调控基因家族,任何一个Hox基因的突变都会引起对应体节器官、组织的异常发育。除跳蚤、衣鱼等少数昆虫没有翅膀以外,大部分昆虫在第二、三胸节着生前后两对翅膀。这两个体节主要为Hox基因Antennapedia（Antp）和Ultrabithorax（Ubx）控制的区域,因此推测翅的发育与这两个基因相关。已有研究表明在果蝇、赤拟谷盗和蝴蝶中,Ubx缺失或过表达导致前后翅（平衡棒）之间的同源异型转化,而在翅原基中下调或异位表达Antp后对翅形态没有任何影响,因此进化发育生物学领域普遍认为昆虫前后翅形态特化的原因是由于Ubx通过在后翅中调控一系列与翅发育相关基因所致,而前翅不受Hox基因Antp调控,处于Antp-free的状态。然而家蚕中存在两个Antp基因功能缺失突变体Nc和Wes,这两个纯合突变体在胚胎期的表型与果蝇Antp纯合突变体相似,均存在胚胎期致死、胸节愈合及胸足向触角转换等特征。但是其杂合突变体能正常发育至成虫,且成虫翅发育缺陷,这个现象在其他物种中并未被提及。基于此,我们推测Antp参与了昆虫翅的发育。本研究中,我们以家蚕、果蝇赤拟谷盗及果蝇为研究对象,通过瞬时干涉、CRISPR-Cas9基因编辑手段及UAS-GAL4双元系统下调Antp的表达,探究Antp是否影响昆虫翅的发育;以家蚕Antp杂合突变体Wes为研究对象,利用ELISA、双荧光素酶、EMSA和Ch IP-PCR等手段探究Antp是如何影响昆虫翅发育的;通过比较蛋白质组学,获得更多Antp调控翅发育的潜在下游靶基因。本研究取得的主要结果如下:1、家蚕翅原基中过量表达Antp不影响翅发育Antp基因在家蚕翅的时空表达模式表明Antp基因在前后翅中均有表达,并且在Antp杂合突变体Wes(Antp+/-)翅原基中的表达强度显著低于野生型大造翅原基中的表达,因此我们推测在翅原基中过量表达Antp后能使家蚕翅变大。我们截取了在蛹翅中特异性高表达的翅原基表皮蛋白基因Bm Wcp4的上游启动子,构建了驱动Antp基因在家蚕翅原基中特异性高量表达的转基因载体,注射入新鲜蚕卵中,在G1代通过红色荧光标签筛选潜在的阳性个体。对筛选到的阳性个体进行分子检测:1、通过反向PCR实验表明,Antp过表达盒的插入位置为基因间区,未破坏其他基因的结构;2、q RT-PCR和Western-blot实验表明,在转录水平和蛋白水平,Antp在翅中的表达均显著上调,因此我们认为在家蚕中的Antp过表达品系构建成功。由于肉眼观察Antp转基因过表达品系的成虫翅形态与野生型无显著差异,因此我们将过表达品系扩大培养后,对衡量翅正常发育的两个指标翅面积和翅负荷进行了精确测量,结果表明过表达品系的翅面积和翅负荷与野生型大造之间无显著差异。2、下调Antp表达导致翅发育异常由于在翅原基中过量表达Antp后,家蚕翅的发育未受影响,因此我们将ds Antp注射入野生型游走期家蚕中,以下调Antp在翅中的表达。结果显示,注射48h后,Antp干涉个体的表达量显著低于对照,对翅原基解剖观察发现,Antp干涉个体翅原基与对照组翅原基在形态上无显著差异,但Antp干涉个体翅原基内部结构翅脉发育不良,该现象与Wes突变体(Antp+/-)翅原基表型一致。化蛾后,Antp干涉个体翅表现为卷曲皱缩,翅型显著变小。为了进一步探究Antp功能丧失后对翅发育的影响,我们利用CRISPR-Cas9编辑手段敲除Antp。将体外转录合成的针对Antp的sg RNA和Cas9蛋白混合均匀后注射入新鲜蚕卵中,G0代成虫出现了与Wes(Antp+/-)一致的异常翅型,对突变表型个体的Antp基因测序,结果表明在设计的靶位点处存在大片段的缺失和少量碱基的插入,导致基因移码突变,引起基因功能的丧失。以上结果表明Antp是家蚕翅发育所必需的。Antp作为Hox家族中的一员,在进化上高度保守。为了阐明Antp基因对翅发育的影响具有广泛的适用性,我们从NCBI数据库中调取了7个目,49种昆虫的Antp蛋白全长序列,进行系统发生树分析和蛋白二级结构分析。其中膜翅目、鳞翅目、鞘翅目、半翅目和直翅目在成虫期有完整的翅结构,而弹尾目和虱目在整个生命周期中不存在翅膀;同一目昆虫均聚在1个分支上,暗示Antp在同一目昆虫中的功能具有一定的保守性。蛋白质二级结构分析显示,所有物种Antp均有Homeodomain结构域,而Hox基因作为转录因子调控下游基因是基于homeodomain区域与DNA结合,进而控制胚胎或动物体特定位置细胞的分化、特化。以上结果表明,在进化上Antp基因控制昆虫胸部组织和器官发育的功能是保守的。为了说明Antp基因在昆虫翅发育过程中的功能是保守的,我们以双翅目昆虫果蝇和鞘翅目昆虫赤拟谷盗为研究对象,下调Antp在翅中的表达。结果显示,Antp表达下调后果蝇和赤拟谷盗成虫翅均发育异常。综上,Antp在昆虫翅发育过程中不可或缺。3、Antp调控20E的合成影响翅发育为了阐明Antp如何影响昆虫翅发育,我们调查了20E合成通路基因在前胸腺、血淋巴及翅原基中的表达情况。q RT-PCR结果显示,仅20E合成路径上的最后一个基因shade在翅原基中表达,且其在Wes(Antp+/-)突变翅中的表达显著低于正常。通过ELISA实验测量了ecdysone（20E的前体）和具有活性的20E在Wes(Antp+/-)突变翅和正常翅中的滴度,结果显示ecdysone滴度在两品系间无显著差异,但20E在Wes(Antp+/-)突变翅中的含量显著低于正常,表明突变翅产生的原因可能是翅中20E含量不足导致的。进一步通过双荧光素酶实验、EMSA和Ch IP-PCR实验证实,Antp可直接结合于shade基因的上游启动子区域以调控shade的表达。基于以上,表明在昆虫翅发育过程中,Antp可通过调控20E合成基因shade控制20E在翅中的合成。4、20E上调Antp在翅中的表达由于Antp在翅中的表达与20E在昆虫中的周期性变化具有一定的一致性,因此我们推测在翅发育过程中,20E可调控Antp的表达。通过JASPAR软件分析Antp启动子区域,发现Antp启动子上存在3个20E核受体Ec R/USP的结合基序。我们将Antp启动子构建进萤火虫光酶报告载体（PGL3-basic）内,将其和海肾光报告载体共转进Bm N细胞后,以添加20E的细胞为实验组,添加20E溶剂DMSO的细胞为对照组,48小时后收集细胞检测Antp启动子的启动活性。结果显示,相较于对照组,添加20E后,Antp启动子的启动活性显著增强。此外,对Bm N细胞和家蚕个体额外添加20E后,Antp的表达较对照组均显著上调。以上结果表明,在昆虫翅中,20E在细胞内和Ec R/USP结合形成复合物后,该复合物结合于Antp启动子区域调控Antp的转录表达。5、Antp通过调控表皮蛋白基因的表达影响翅发育为了探究除shade外,是否还有其他基因对Wes(Antp+/-)突变翅型异常的表型有贡献,,基于非依赖数据采集（data-independent acquisition,DIA）蛋白质组学技术,对两品系的翅进行了比较蛋白组分析。结果显示,共鉴定到3993个蛋白质,其中差异蛋白370个（P-value<0.01,|log2FC|>0.58）。相较于正常翅,Wes(Antp+/-)突变翅中鉴定到238个蛋白表达上调,132个蛋白表达下调。我们调查了3个在家蚕翅原基中表达模式与Antp一致的表皮蛋白基因（CPH28,CPG24,CPG9）,在Wes(Antp+/-)突变翅和正常翅中的表达情况。结果显示三个表皮蛋白基因在Wes(Antp+/-)突变翅的表达相较正常翅中的表达均显著下调。在Bm N细胞中,过量表达Antp后,三个表皮蛋白基因较对照组均显著上调,随后我们以CPH28为例,通过双荧光素酶实验和体内外结合实验证明Antp蛋白可直接结合于CPH28启动子区域调控其表达。在蛹期下调CPH28的表达后,成虫翅型缺陷。表明表皮蛋白在翅发育过程中非常重要。综上所述,本研究表明在家蚕、果蝇和赤拟谷盗中敲低或敲除Antp后会导致成虫翅变小,且卷曲皱缩。并证实Antp通过直接调节翅原基中蜕皮激素合成基因Shade的表达而调控蜕皮激素20E的含量;同时,Antp通过与翅表皮蛋白基因的顺势调控原件结合,进一步调控翅的发育。本研究表明前翅发育不是Hox-free,Antp基因对翅发育不可或缺,以丰富调控翅发育的分子机理,并为鳞翅目害虫的防治提供新的靶点。