论文部分内容阅读
垂体瘤(Pituitary Adenomas,PA)侵袭周围组织结构,使得手术切除治愈率低,这导致许多病人在手术失败后病情进展。为了降低此类患者的复发率和死亡率,需要有效和安全的诊断及治疗方案。微创液体活检有可能提高早期筛查效率,并可以监测预后。从PA组织中获得的生物标志物可以很好的评估及监测垂体瘤。因为PA通常是由许多较小的遗传或表观遗传变化的累积效应发展而来。许多长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,LncRNAs)与PA的发生发展有关,这可能是寻找诊断测试有效标记的重要物质之一。由此研究的靶向药物可能对治疗效果更为有利。本研究旨在探讨lncRNA MEG3在垂体瘤中的作用及其机制。第一部分LncRNA MEG3在垂体瘤组织中的表达目的:检测lncRNA MEG3在垂体瘤患者中的表达。方法:1.GSE77517从GEO数据库下载。2.搜集垂体瘤患者肿瘤组织样本和正常癌旁组织样本34对,qRT-PCR检测lncRNA MEG3表达。3.qRT-PCR检测不同分期垂体瘤肿瘤组织中MEG3的表达。4.Pearson’s χ2分析MEG3的表达与垂体瘤患者临床特征的关系。结果:1.相较于正常组织,lncRNA MEG3在垂体瘤肿瘤组织中表达量显著降低。2.LncRNA MEG3在Ⅲ-Ⅳ期垂体瘤患者组织中的表达显著低于Ⅰ-Ⅱ期垂体瘤患者。3.LncRNA MEG3的表达与垂体瘤的侵袭性和临床等级显著相关。结论:LncRNA MEG3在垂体瘤患者组织中低表达并与垂体瘤的侵袭性和临床等级显著相关。第二部分LncRNA MEG3对大鼠垂体瘤细胞活性的影响目的:探讨LncRNA MEG3对大鼠垂体瘤细胞活性。方法:1.设计MEG3过表达序列,在大鼠PA细胞MMQ和GH3中上调MEG3的表达。2.细胞增殖通过CCK-8法检测。3.流式细胞仪和蛋白质印迹法检测PA细胞凋亡。4.细胞迁移和侵袭均通过Transwell法检测。5.蛋白质印迹法检测EMT相关因子(E-cadherin,Twist,Slug,MMP-7)的相对蛋白表达量。结果:1.MEG3表达的上调可以抑制PA细胞GH3和MMQ细胞增殖能力。2.MEG3表达的上调可以促进垂体瘤细胞GH3和MMQ细胞凋亡。3.MEG3表达的上调可以抑制垂体瘤细胞GH3和MMQ的细胞增殖,细胞迁移和侵袭能力。4.MEG3表达的上调可以增加垂体瘤细胞GH3和MMQ中E-cadherin的表达,并抑制Twist,Slug和MMP-7的表达。结论:LncRNA MEG3的上调可以促进大鼠垂体瘤细胞凋亡并抑制其增殖,迁移,侵袭和EMT。第三部分 LncRNAMEG3 靶向 miR-23b-3p/FOXO4目的:探讨lncRNAMEG3调控垂体瘤的分子机制。方法:1.在线生物学工具预测MEG3靶向的miRNA。2.荧光素酶报告实验检测预测结果。3.RNA pull down实验检测预测结果。4.qRT-PCR检测该miRNA在转染了 MEG3/NC后的GH3和MMQ细胞中的表达。5.qRT-PCR检测该miRNA在垂体瘤组织样本中的表达。6.Spearman’s相关分析计算垂体瘤组织中miRNA的表达和MEG3表达的相关性。7.在线生物学工具预测miRNA下游的mRNA。8.荧光素酶报告实验验证该预测。9.RNA pull down实验检测预测结果。10.蛋白质印迹法和qRT-PCR均被用来转染后的PA细胞中该基因的表达。11.qRT-PCR检测垂体瘤肿瘤组织中该mRNA的表达。12.Spearman’s相关分析计算MEG3/miR-23b-3p和预测的mRNA表达的相关性。结果:1.LncRNA MEG3靶向miR-23b-3p。2.在垂体瘤细胞GH3和MMQ中,上调MEG3的表达可以抑制miR-23b-3p的表达。3.miR-23b-3p在正常组织中的表达显著低于其在垂体瘤组织中的表达。4.在PA肿瘤组织中,miR-23b-3p的表达和lncRNA MEG3的表达呈负相关。5.LncRNA MEG3/miR-23b-3p 靶向 FOXO4。6.在垂体瘤细胞 GH3 和 MMQ 中,上调 miR-23b-3p的表达可以抑制FOXO4的表达。7.在垂体瘤细胞GH3和MMQ中,上调lncRNA MEG3的表达可以增加FOXO4的表达。8.FOXO4在垂体瘤组织中显著低表达。9.在垂体瘤肿瘤组织中,FOXO4的表达和MEG3成正相关,FOXO4的表达和miR-23b-3p的表达呈负相关。结论:LncRNA MEG3 在垂体瘤中靶向 miR-23b-3p/FOXO4。第四部分LncRNA MEG3通过靶向miR-23b-3p调控垂体瘤细胞活性和EMT目的:探讨lncRNA MEG3作用于垂体瘤的机制。方法:1.根据不同的处理,将大鼠垂体瘤细胞GH3分为三组:shNC+miR-NC,shMEG3+miR-NC和shMEG3+miR-23b-3p inhibitor。2.通过CCK-8方法来检测细胞的增殖。3.流式细胞仪和蛋白质印迹法检测PA细胞凋亡。4.细胞迁移和侵袭均通过Transwell法检测。5.蛋白质印迹法检测EMT相关因子(E-cadherin,Twist,Slug,MMP-7)的相对蛋白表达量。结果:1.在大鼠垂体瘤细胞GH3中下调lncRNA MEG3的表达可以显著促进细胞增殖,而同时在GH3细胞中下调miR-23b-3p的表达可以很大程度上恢复该影响。2.在大鼠垂体瘤细胞GH3中下调lncRNA MEG3的表达可以抑制细胞凋亡,而同时在GH3细胞中下调miR-23b-3p的表达可以恢复该影响。3.在大鼠垂体瘤细胞GH3中,下调lncRNAMEG3的表达均可以增加细胞的迁移和侵袭,而同时下调miR-23b-3p的表达后,可以抵消上述影响。4.下调lncRNA MEG3的表达均可以促进GH3细胞的EMT,而同时下调miR-23b-3p的表达可以消除该影响。结论:lncRNA MEG3通过靶向miR-23b-3p调控垂体瘤细胞的增殖,凋亡,迁移,侵袭和EMT。