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主要组织相容性复合体(MHC)是脊椎动物体内某一染色体上的一组紧密连锁的具有高度多态性的基因群。根据结构和功能的不同，MHC的基因产物可分为两种类型，即MHCⅠ类和MHCⅡ类分子。MHCⅡ类分子是呈现免疫系统的特定细胞表面的由A链和B链非共价键结合组成的一组具有高度多态性的跨膜糖蛋白[1]。近期发现，可溶性的MHCⅡ类分子（尤其是多聚形式存在的可溶性pMHC，例如以二聚体形式）通过和表位特异性T细胞的结合，可以发挥免疫调节的作用，其机制是：①封闭了特异性TCR；②可溶性PMHC与TCR结合只能提供T细胞激活的第一信号，但是缺乏第二信号，这样会引起T细胞的失能和克隆清除，因而能够抑制T细胞对抗原的应答。前期，我们实验室利用抗原肽MOG35-55诱发了C57BL/6小鼠的EAE模型，T细胞的识别表位比较明确，这些表位可以诱导自身反应性CD4+T细胞应答，造成免疫损伤。实验室已经构建出了与上述CD4+T细胞特异性结合可溶性pMHC（MOG35-55-I-Ab/Fc）二聚体，作用于EAE小鼠模型的体内外干预实验，以期能够缓解小鼠EAE模型的发病症状。然而，之前制备的几种I-Ab/Fc二聚体存在着表达产量和生物学活性均较低的问题，并且存在着纯化条件不够成熟，只用PEG浓缩纯化不太完全，用于EAE小鼠干预实验，对于进一步探索治疗EAE发病小鼠的发病机制和治疗效果均产生不利影响。因此，为了筛选出I-Ab/Fc二聚体的较高表达产量和优化纯化条件，以期达到理想的预期结果。本实验研究的主要内容及结果如下:1含昆虫信号肽（gp-67信号肽）基因序列的真核表达载体的构建。利用信号肽来引导外源蛋白定位分泌到细胞特定区间,提高可溶性,可避免因包涵体复性带来的困难[2]。在原核表达系统里，如乳酸杆菌，大肠杆菌等都得到了表达和分泌；信号肽也广泛地应用于真核表达系统如毕赤酵母和昆虫杆状病毒表达系统中[3]。为了提高I-Ab二聚体的蛋白表达分泌水平，我们将先前制备好的含有目的基因片断通过用含昆虫信号肽的引物用重叠PCR技术，再利用酶切和连接，将含有昆虫信号肽基因的序列加载在目的片段a和β片段前段。利用基因重组技术，将含有昆虫信号肽（gp67信号肽）的I-Ab-a-Fos与IgGFcγ2b顺序连入双表达载体pFastBacT MDual的Ph启动子的下游，同样将含昆虫信号肽的I–Ab-β-Jun连入PFastBacT MDual的P10启动子下游，获得了pFastBacT MDual[gp67-I-Ab/Fc]重组质粒；经过测序比对显示无有义突变，表明真核表达载体构建成功。2I-Ab/Fc融合蛋白表达水平的优化筛选、纯化优化及功能将之前构建的四种质粒（MOG，去-MOG，K-MOG和K-去MOG的质粒）和新构建的pFastBacTMDual[gp67-I-Ab/Fc]，依据bac-to-bac昆虫表达系统操作说明，将以上重组质粒转化大肠杆菌DH10T ME coli.，获得重组Bacmid杆粒，通过转染试剂分别转入SF9细胞，收上清，做PAGE、ELISA检测，最后发现含有Kozak序列即（K-MOG二聚体）序列的蛋白表达水平最高，并且具有较好的构象，达到了预期的实验结果，显著地提高了蛋白的产量，并做了下一步的纯化优化工作，以期得到产量较高，纯度较高，活性较好的I-Ab/Fc最优化选择，为进一步的实验做好奠定良好的基础。最后将经过纯化后的I-Ab/Fc（K-MOG二聚体）二聚体干预EAE小鼠的体外细胞实验，成功抑制了CD4+T细胞的增殖反应，显示出了K-MOG的有效性，证明了筛选和纯化过程的结果是正确的，达到了我们的预期试验结果。