糖尿病肾脏疾病(Diabetic kidney disease,DKD)已成为终末期肾功能衰竭的最重要原因之一。DKD早期可出现肾小管间质纤维化,且不依赖肾小球病变直接加速肾功能的恶化,但其机制复杂。研究肾间质纤维化的发病机理、靶向阻断参与纤维化的细胞及信号通路,延缓DKD肾小管间质纤维化、阻止肾功能的进展已成为当前的研究热点。以往认为DKD是一种非炎症性疾病,近年来关于炎症细胞及炎症因子在DKD肾间质纤维化中的作用越来越受到重视,而肥大细胞作为一种重要的炎症细胞也逐渐被关注。肥大细胞起源于骨髓CD34+多能祖细胞,肥大细胞胞浆颗粒中富含炎症介质,大量研究发现肥大细胞参与了许多慢性肾脏病的肾间质纤维化。有研究报道DKD患者肾活检组织中肾间质肥大细胞表达明显增加,并与肾间质纤维化的程度及肾功能的进展密切相关。但肥大细胞参与DKD肾间质纤维化的具体作用机制及信号通路尚不完全清楚。SCF/c-Kit是促进肥大细胞的募集及活化的信号通路,SCF、c-Kit可在肾间质细胞及肾小管上皮细胞中表达,而且SCF可促进胶原的合成及细胞外基质的聚集,其在DKD肾间质纤维化中的作用有待进一步研究。目的本课题拟通过检测DKD患者肾组织,同时建立DKD动物模型,从三个方面进行研究：1、检测肥大细胞在DKD患者肾间质的浸润情况及与肾间质纤维化的关系；2.通过肥大细胞膜稳定剂--曲尼斯特干预,观察肥大细胞对DKD大鼠肾间质纤维化的作用；3.通过曲尼斯特干预,探讨肥大细胞介导DKD肾间质纤维化的机制是否与阻断SCF/c-kit有关。研究肥大细胞在DKD肾间质纤维化中的作用及机制,为开发研究延缓肾功能进展的有效药物提供理论依据。方法1.收集2010～2011年来我院肾内科就诊,并于我院肾脏病研究所行肾活检,结合临床及病理诊断为DKD患者共14例。同时选取7例诊断为微小病变的病例作为对照组,所选取的对照组肾组织病变轻微,未见明显炎症细胞浸润及间质纤维化。应用甲苯胺蓝染色检测肥大细胞浸润,免疫组化检测DKD肾组织及微小病变肾组织肥大细胞特异性标志--C3aR的分布情况2.建立DKD大鼠模型：SD大鼠随机分为正常对照组(n=6)、DKD模型组和曲尼斯特低剂量和高剂量治疗组(n=24)。采用高糖高脂饲料喂养联合低剂量STZ注射诱发SD大鼠DKD模型(STZ溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,pH值4.5),对照组只注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,72h后测定血糖和尿糖,血糖值≥16.7mmol/L,尿糖值+++～++++者确定为糖尿病模型。成模后,曲尼斯特治疗组予曲尼斯特(200mg/kg/d和400mg/kg/d)分2次灌胃。于第8周末处死大鼠,收集大鼠24小时尿液测24小时尿白蛋白排泄量,收集血测肾功能及血白蛋白,取部分肾组织置于4%中性甲醛溶液中固定,观察各组之间肾脏病理学变化。采用免疫组化方法检测肾组织C3aR、FN、Col I、SCF和c-kit表达以及分布情况,用Western blot及PCR方法检测肾组织FN、 Col I、 SCF和c-kit蛋白及mRNA的表达情况。结果1.DKD患者肾间质肥大细胞的浸润较微小病变患者明显增加,并与肾间质纤维化损伤及肾功能进展密切相关。2.成功构建DKD模型：72h测定血糖和尿糖,血糖值≥16.7mmol/L,尿糖值+++～++++,确定为糖尿病模型。8周末时,糖尿病大鼠的血糖显著高于正常对照组,且出现了明显的“三多一少”症状,检测尿白蛋白明显增高,Masson染色肾小管间质出现明显的胶原沉积,说明DKD大鼠模型建立是成功的。正常肾组织肾小管间质区域及髓质部分偶可见肥大细胞,8周末糖尿病肾组织肥大细胞浸润明显增加。3.与正常对照组比较,DKD模型组肥大细胞浸润明显增加,肾小管间质胶原相对面积增加(P<0.05),肾小管间质区域Col I、 FN的表达增加。肥大细胞阻断剂-曲尼斯特能明显抑制Col I、 FN的表达,肥大细胞浸润和Col I、 FN的表达呈正相关(P<0.05)。4.正常大鼠肾小管及肾间质可见少量SCF蛋白表达,未见明显的c-Kit蛋白表达,DKD大鼠肾组织SCF、 c-Kit蛋白及mRNA表达增加,曲尼斯特能抑制SCF、 c-Kit mRNA及蛋白的表达(P<0.05)。肾组织SCF、 c-kit蛋白的表达与肾组织肥大细胞浸润程度及肾小管间质FN、 col-I蛋白的表达呈显著正相关。结论(1)肥大细胞可能在DKD患者肾间质纤维化过程中起作用。(2)DKD大鼠肾间质肥大细胞浸润与肾组织FN. Col I的表达密切相关,提示肥大细胞参与了DKD肾间质纤维化。(3)DKD大鼠肾组织SCF、 c-kit的表达明显增加,曲尼斯特通过抑制SCF、 c-kit的表达从而减少肥大细胞的浸润,缓解DKD肾间质纤维化的进展。说明肥大细胞可能通过SCF/c-kit信号通路,介导DKD肾间质纤维化。