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背景 骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）因具有多向分化潜能而被公认为理想的种子细胞。骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2,BMP2）和血管内皮生长因子165（Vascular endothelia growth factor 165,VEGF165）分别是目前公认的成骨诱导因子和血管再生因子。多孔纳米羟基磷灰石/聚酰胺66（nano-hydroxyapatite/polyamide66,n-HA/PA66）因其良好的的生物学和力学性能已被广泛应用于临床。本实验将采用hBMP2与hVEGF165双基因腺病毒载体转染BMSCs复合多孔n-HA/PA66体外构建组织工程骨并植入体内观察,旨在为临床上应用组织工程骨治疗骨缺损提供可靠的理论支持和依据。目的 本实验拟通过体外构建hBMP2与hVEGF165双基因腺病毒转染BMSCs复合多孔n-HA/PA66组织工程骨并检测其诱导成骨分化能力,继而植入体内以观察评定其在兔桡骨缺损修复模型中的修复能力。方法 1.采用髂骨穿刺抽吸骨髓液,密度梯度离心分离BMSCs,种植于25cm3培养瓶中,48h后换液,观察BMSCs的大体形态,细胞融合度达80%以上传代培养,取第3代BMSCs进行细胞表型鉴定。2.取第3代生长良好的BMSCs作为实验对象,计算细胞数,使用不同感染复数感染BMSCs,48h后换液,2d后倒置相差显微镜下观察细胞状态并使用倒置荧光显微镜观察转染情况,找出最佳MOI值,并进行ELISA检测细胞hBMP2和hVEGF165的表达;将感染后的细胞接种到n-HA/PA66生物材料上,于转染后1w、2w、3w、4w进行碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性测定并于3w、4w进行茜素红染色观察并电镜扫描观察。3.使用1%的戊巴比妥钠（3.5ml/kg）进行麻醉新西兰大白兔,手术制作桡骨中段15mm长骨缺损,将组织工程骨植入骨缺损部位,逐层缝合伤口。4.在术后2w、4w、8w、12w,进行X线、CT三维重建观察骨缺损愈合情况,并取出组织工程骨并进行HE、甲苯胺蓝、Masson染色观察成骨及血管形成情况。结果 1.细胞分离培养48h后换液,倒置显微镜下观察,可见少量贴壁细胞,呈多角形或梭形,随时间延长,细胞呈集落生长并增大,形成漩涡状或人字状细胞排列,原代细胞5-7d即可达80%融合度以上,随着传代次数增多细胞呈梭形改变,细胞形态逾趋一致,待3代左右细胞纯度可达95%以上。3代细胞经流式细胞仪检测其细胞表型:CD29（99.82%）和CD44（94.14%）,低表达CD14（3.11%）和CD34（0.34%）。2.Ad-BMP2,Ad-VEGF165腺病毒载体由山东大学魏奉才教授馈赠,Ad-BMP2-VEGF165重组腺病毒载体由上海生工构建,病毒滴度达1×1010PFU/ml。分别转染bmscs后,elisa检测hBMP2和hVEGF165蛋白表达水平,BMP2、VEGF165在3-28d均有表达,3-5d时达到高峰,5d后开始降低。倒置相差显微镜下观察生长状态良好,倒置荧光显微镜观察GFP正常表达,转染效率在90%以上。在3w、4w时茜素红染色观察显示各组均已形成钙结节及矿化区,但双基因组优于其他各组,BMP2、VEGF165次之,BMSCs最差。扫描电镜观察钙化结节并可见细胞紧密粘附于支架材料上,4w周时,双基因组可见密集的钙结节形成,其他各组也有不等量钙结节形成。碱性磷酸酶活性检测结果显示双基因组在各个时期均高于其他各组,各组间差异均有统计学意义（p<0.05）。3.手术构建兔桡骨中段长15mm骨缺损模型,尺骨保存完整,各组植入物均稳定植入且术中术后无移位。术后观察切口无感染、红肿等异常情况。4.在术后2w、4w、8w、12w,行X线、CT三维重建观察显示植入物位置良好,且与周围组织生长紧密,在不同时相点均可清楚观察到骨缺损有程度不同的修复,在12w时可见双基因复合多孔n-HA/PA66组支架材料已被骨皮质完全包裹,取出组织工程骨行HE、甲苯胺蓝、Masson染色观察成骨及血管形成情况。C2组各时相点各观测指标均优于其他组（p<0.05）;B1组血管数较B2组为优（p<0.05）,同时C1组血管计数明显优于A2组（p<0.05）;各组各时相点观察结果均优于A1（p<0.05）。结论1.BMSCs无论在体内还是在体外均具有向成骨细胞分化的潜能,可作为种子细胞应用于构建组织工程骨。2.BMSCs被Ad-BMP2-VEGF165双基因腺病毒转染后可以正常的生长,并能够持续高量表达目的蛋白,转染后的BMSCs能在多孔n-HA/PA66网孔上良好的生长、黏附并矿化。3.hBMP2与hVEGF165双基因腺病毒转染BMSCs复合多孔n-HA/PA66构建组织工程骨可有效地促进骨缺损修复。