第一部分 妊娠期甲状腺过氧化物酶抗体动态变化及其亚类分析　　背景：　　甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)是一种糖基化血红素蛋白，是甲状腺激素合成的关键酶，参与甲状腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)分子上酪氨酸残基的碘化与碘化酪氨酸的偶联。TPO是微粒体抗原的主要成分，是甲状腺自身免疫（thyroid autoimmunity，TAI）的器官特异性自身抗原。　　甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)旧称甲状腺微粒体抗体，血清中TPOAb是多克隆IgG类抗体，可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚类。其中以IgG1、IgG4亚类抗体为主。它们中大部分可作用于TPO分子上的免疫优势区(IDR)。其中IgG1、IgG2、IgG3亚类可激活经典的补体途径(CDC效应)和介导抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)，IgG4亚类可阻断补体的活化。有报告指出，在桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis，HT)患者中TPOAb阳性者几乎占100％，而甲状腺球蛋白抗体（TgAb）阳性者占80％。在甲状腺功能正常的人群中TPOAb阳性率可达12％-26％。世界范围内妊娠妇女TPOAb阳性率为2.8％-19.6％。近十余年来，TPOAb阳性妇女妊娠与妊娠不良结局之间的关系逐渐得到了人们的认识和关注。TPOAb阳性妇女妊娠与流产、早产等妊娠不良结局及不孕之间相关。　　近几年的临床研究提示，给予TPOAb阳性妊娠妇女左甲状腺素(L-T4)、硒干预等可以改善妊娠不良结局，但研究结果并不十分一致。因此，本研究通过大型的临床多中心妊娠早期亚临床甲状腺功能减退筛查及随访项目（SHEP项目）募集TPOAb阳性的妊娠早期妇女，给予其L-T450微克/天干预，观察整个妊娠过程中TPOAb的动态变化，以及L-T4干预对TPOAb滴度的影响。同时探讨TPOAb与甲功、铁营养状态之间的关系。另外，我们拟应用SHEP项目中TPOAb阳性妊娠妇女随访获得的分娩时点的母血与新生儿脐带血(14对)，分析TPOAb各IgG亚类通过胎盘的能力。　　方法：　　从4206名妊娠小于8周的妇女中筛选出123名TPOAb阳性及656名TPOAb阴性甲功正常的志愿妇女作为研究对象。测量促甲状腺素(TSH)、游离甲状腺素(FT4)、TPOAb、血清铁蛋白(SF)等。将研究对象分为TPOAb阳性L-T4干预组(n=89)、TPOAb阳性对照组(n=34人)和TPOAb阴性对照组(n=656)。在妊娠第14、20、30周进行随访，测定上述指标，观察各指标动态变化及L-T4干预是否能降低TPOAb滴度。同时探讨TPOAb与甲功、铁营养状态之间的关系。　　测定14对母血与脐带血的TPOAb、TSH、FT4、游离三碘甲腺原氨酸(FT3)水平，ELISA法测定母血与脐带血TPOAb IgG亚类。分析和比较母血及脐带血TPOAbIgG亚类组成比例的异同及各IgG亚类的胎盘通过率;分析母血与脐带血TPOAb及其IgG亚类之间的相关关系。　　SPSS16.0进行统计分析，SHEP数据以中位数（25th，75th百分位数）的形式表示，各指标随妊娠期动态变化采用非参数检验中多个相关样本分布检验。妊娠各期TPOAb与其他参数的相关分析采用Spearman秩相关分析，协方差分析比较干预前后TPOAb滴度变化。TPOAb阳性干预组、阳性对照组和阴性对照组各期数据组间比较采用秩和检验。妊娠7周横断面数据按TPOAb≥300 IU/L分层比较时采用秩和检验。IgG亚类分析中，所有数据采用均数（标准误）的形式表示。两组数据的比较采用独立样本t检验，多组数据的比较采用One-way ANOVA，LSD法分析，对拟分析数据进行正态性分布检验均符合正态分布，故相关分析采用Pearson双变量相关分析。以p＜0.05为差异有统计学意义。　　结果：　　TPOAb阳性干预组各随访时点TPOAb中位数分别为271.90、155.70、119.30及81.04 IU/L。随妊娠时间推移，各个随访时间点TPOAb滴度均较前一时间点显著下降(p=0.000)。妊娠30周较妊娠7周TPOAb滴度下降了70.1％。　　TPOAb阳性对照组各随访时点TPOAb中位数分别为180.00、145.70、92.07及63.23 IU/L。妊娠30周较妊娠7周TPOAb滴度下降了65.0％。　　妊娠7周横断面，应用Spearman秩相关我们发现:TSH与TPOAb呈显著正相关(r=0.128，p=0.000)、FT4与TPOAb显著负相关（r=-0.121，p=0.001）。但按照TPOAb是否≥300 IU/L进行分层时，TPOAb阳性的两层内各指标比较无统计学差异，未观察到SF、TSH、FT4等指标与TPOAb间存在相关性。两层数据与TPOAb阴性对照组比较时，均比阴性对照组FT4显著降低（p值均＜0.01），且TSH显著升高(p＜0.05)。在随后的观察中TPOAb阳性干预组、阳性对照组和阴性对照组各个时点内，未发现TPOAb与上述指标间存在相关关系。应用L-T4干预对TPOAb影响的效果分析提示L-T4不能进一步降低TPOAb滴度。　　母血与脐带血TPOAb IgG亚类的构成比例无显著差异;母血IgG1与脐带血IgG1正相关(r=0.725，p=0.003)、母血IgG4与脐带血IgG4正相关(r=0.907，p=0.000); TPOAb IgG1、IgG3亚类胎盘通过率显著高于IgG2和IgG4亚类（p值均＜0.05）。　　结论：　　1、妊娠期TPOAb水平逐渐下降，应用L-T4干预不能进一步降低TPOAb的滴度。　　2、妊娠期TPOAb阳性与SF、TSH、FT4无相关性，L-T4干预没有影响TPOAb和上述指标的相关性。　　3、妊娠末期TPOAb IgG1、IgG3亚类胎盘通过率最高。　　第二部分 甲状腺过氧化物酶抗体升高的动物模型的建立　　背景：　　甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)是一种糖基化血红素蛋白，是甲状腺激素合成的关键酶，参与甲状腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)分子上酪氨酸残基的碘化与碘化酪氨酸的偶联。TPO是微粒体抗原的主要成分，是甲状腺自身免疫（thyroid autoimmunity，TAI）的器官特异性自身抗原。　　近十余年来，TPOAb阳性妇妊娠与妊娠不良结局之间的关系逐渐得到了人们的认识和关注。TPOAb阳性妇女妊娠与流产、早产等妊娠不良结局及不孕之间相关。在众多妊娠不良结局中，TPOAb阳性妇女妊娠影响后代的智力发育引起了我们的关注。Pop等于1995年研究发现妊娠期间甲功正常TPOAb阳性妇女生育的后代，出生后5年其反映智商的一般认知量表(general cognitive scale)得分较抗体阴性母亲生育的后代低10.5分(p=0.005)，该研究表明妊娠期甲功正常TPOAb升高是后代发育受损的危险因素。本课题组李元宾等在对妊娠16-20周TPOAb阳性甲功正常的妇女生育的后代进行研究时发现:在其25-30月龄时进行智力评分和运动评分，实验组较对照组分别低10.56分(p＜0.01)和9.03分(p＜0.01)。这提示TPOAb阳性在妊娠16-20周时可能给后代智力和运动发育造成不良影响。　　目前，TPOAb影响后代智力的机制尚不清楚且缺乏相关机制研究的报告，亟需通过构建TPOAb升高的动物模型来探讨相关机制，丰富我们对疾病发生发展的认识，为临床干预提供可能的选择。因此，本研究拟建立TPOAb升高的动物模型，为下一步的机制研究做准备。　　方法：　　将构建好的插入了小鼠甲状腺过氧化物酶cDNA全长的腺病毒载体(mTPO-Ad)CMV-MCS GV269体外感染HepG2细胞，Western Blot鉴定是否有目的蛋白表达。　　经鉴定后，8周龄C57BL/6雌性小鼠进行免疫。分别给予:腺病毒1.0×1010PFU/只·次（A组）10只;腺病毒2.5×109PFU/只·次（B组）10只;对照组（C组）给予PBS140μ L/只·次10只，大腿肌肉注射，共3次，每次间隔3周。　　于免疫完毕后的第3、6、9周内眦静脉采血分离血清，第12周处死实验动物留取血清和甲状腺。　　ELISA法检测各个采血点小鼠TPOAb(mTPOAb)、小鼠甲状腺球蛋白抗体(mTgAb)，免疫完毕后第3周、第12周的血清促甲状腺素(TSH)、游离甲状腺素(FT4)，免疫结束后第12周的甲状腺进行HE染色甲状腺炎评分、甲状腺淋巴细胞CD45分子染色及ELISA法检测血清干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-2、4、10。　　为了使mTPOAb进一步升高，我们选取新的6周龄C57BL/6雌鼠进行了第二批免疫。免疫方法同上，免疫剂量为2.0×1010PFU/只·次（D组，10只），对照组给予PBS200μ L/只·次(C2组，10只)。于免疫完毕后第6周处死实验动物，ELISA法检测血清mTPOAb、mTgAb、TSH、FL，甲状腺进行HE染色观察甲状腺炎，小鼠脾细胞流式细胞术测定辅助性T细胞(Th)1、Th2、Th17和调节性T细胞(Treg)的比例。　　ELISA法测定小鼠（mTPOAb升高组，E组和对照组C3组各6只）血清中mTPOAbIgG总及IgG各亚类。分析IgG各亚类的组成情况，分析IgG各亚类与mTPOAb IgG总水平之间的相关性。　　结果：　　Western Blot仅mTPO-Ad组在130KD处显示特征性条带。　　动物免疫后，其中A组各个采血时点mTPOAb滴度均较C组升高有统计学差异（p值分别为0.012，0.012，0.015及0.037），B组在免疫结束后第12周时mTPOAb滴度较C组升高有统计学差异(p=0.010)。各组间各时点的mTgAb滴度比较均无统计学差异。免疫后第12周A组血清IFN-γ较C组显著升高(p=0.039)。　　A组、B组、C组甲炎评分的平均秩次分别为7.20，7.80，3.80。其中B组与C组相比甲炎评分升高有统计学差异，p=0.039（秩和检验）。CD45免疫组织化学染色可见A组、B组甲状腺组织中有一定量的浅棕色的细胞分布，且C组中该种着色细胞很少或没有。　　D组较C2组mTPOAb滴度显著升高(p=0.017)，而TgAb滴度、甲功水平无差异。流式细胞染色各T细胞亚群两组比较无差异。甲状腺HE染色两组均未观察到典型淋巴细胞浸润。　　E组IgG2a及IgG2b的水平要明显高于C3组（p值分别为0.019及0.014）;在各IgG亚类所占比例中，E组IgG1比例显著低于C3组(p=0.030)，同时IgG2a比例显著高于C3组(p=0.040)。提示，mTPOAb的升高主要以IgG2a亚类抗体升高为主。　　结论：　　1、应用mTPO-Ad免疫C57BL/6小鼠能够建立TPOAb升高的动物模型。　　2、mTPOAb升高的小鼠模型中，以mTPOAb IgG2a亚类升高为主。