进入21世纪后，恶性肿瘤将仍是威胁人类健康的严重疾病，尽管多年以来以手术，放疗和化疗为主的肿瘤常规治疗手段的均已取得了长足的进展，但是由于肿瘤来源于正常细胞，常规的治疗始终无法达到根治目的，而且副作用较大。免疫治疗是继手术，化疗，放疗以后一新兴肿瘤治疗手段，它有着特异性强、毒副作用小的特点而被认为是21世纪有望攻克肿瘤的强大武器之一。 作为特异性主动免疫治疗之一的肿瘤疫苗是目前研究的热点。虽然肿瘤疫苗的研究已取得初步进展并预示有良好的开发前景，但由于对肿瘤抗原认识不足、抗肿瘤免疫机制未明、免疫耐受等问题，所以肿瘤疫苗的研究仍然任重道远。一些人类的恶性肿瘤与病毒感染有关，由这些病毒基因产生的蛋白是特异性良好的肿瘤抗原。人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一类与人类多种肿瘤相关的病毒，其中16型HPV与女性宫颈癌发生密切相关。由HPVl6E7基因产生的早期蛋白E7与细胞的转化和恶性变密切相关，并且被认为是HPV相关肿瘤特异性肿瘤排斥抗原，含有多个线性B细胞表位、CD4+T细胞表位和CD8+CTL表位。因此，HPV16E7是HPV相关肿瘤免疫治疗中非常有前途的靶抗原。 由于HPV感染有高度的种属特异性，严格的嗜上皮性、不能在体外常规细胞培养系统中繁殖等特点，因此，HPV相关肿瘤疫苗的研制，疗效评价和免疫机理的研究难以深入。为克服上述困难，本文通过基因工程方法，将HPV16E7基因导入小鼠肿瘤细胞，以建立表达HPV16E7抗原可移植小鼠肿瘤细胞系。该细胞系的建立可以为HPV16E7的致病机理研究、HPV16疫苗制备和HPV16E7表达小鼠肿瘤模型的建立 浙江大学医学院 顾上学位论文 提供一些实验基础和经验。 方怯： 1 重组真核表达载体的构建设计分别含 eOR和 eOR＼，限制性酶切位点的一对 引物，通过盯R反应产生HPV16E7基因。然后回收纯化KR产物，亚克隆到PGEM－T 克隆载体。提取亚克隆质粒酶切鉴定后，双酶切并回收纯化切下的HPV 16E7基因。二 最后，回收产物连接真核表达载体pCD＼A3．1卜），酶切并测序鉴定重组表达载体。 真核表达载体命名为 pCD＼A：3 IHP＼’16E7。 2 转染和抗性细胞克隆筛选用脂质体法转染重组表达载体于h 细胞，孵育3小 时后换液。转染后 24小时，l：5传代 G418 800 u g。l筛选，之后每 2－3天换液 一次。14大后可见抗性细胞克隆生成，用毛细管法挑取克隆继续扩大培养。 3 阳性细胞克隆鉴定 当克隆长满6孔扳时，用Trizol法提取每个克隆的总队A。 然后以GAPDH为内对照，用叩＼『16E7引物进行RT－PCR检测HPV16E7表达的阳性克隆 细胞株。 结果： 我fi’」成功构建含HP＼’16ET基因的重组表达载体，并通过酶切及测序鉴定。经该 载体转染的＊ 细胞，m G418筛选川刁 天后出现抗性克隆。我JJ’J用毛细管法成功 挑取克隆，并扩大培养。盯－厂R检测抗性克隆细胞，发现I个抗性克隆中有u个 克隆HPV16F了 mRNA表达阳性，其中S个表达较强。 结论： l 成功沟建真核表达载体pCDNA3／HPV16E7，并能在B16细胞中转录表达。 2．用脂质体成功转染HPV16E7 fd B16细胞中，并筛选到G418抗性细胞克隆。 3．筛选到的G418抗性细胞克隆中大部分可检测到HPV6E7 nRNA表达阳性。 4．初步建立HPV16E7表达的小鼠肿瘤细胞系，HPV16E7蛋R表达及抗原性需要进一 步鉴定。