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研究背景胰腺癌是一种进展迅速的消化系统恶性肿瘤,5年存活率低于5%,手术切除率仅15%-20%。因此化疗在胰腺癌的治疗中具有极为重要的地位。吉西他滨是胰腺癌临床治疗的一线化疗药物,但由于患者对化疗反应存在个体化差异,故其临床疗效并不令人满意。脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, dCK)是吉西他滨等核苷类药物体内代谢过程中的关键酶,其活性直接影响到上述药物的化疗疗效。单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism, SNP)是指基因组DNA序列中频率大于1%的单个核苷酸的变异。位于基因非编码区和编码区的SNP可分别影响基因的表达和编码蛋白的合成,最终影响蛋白的活性和功能。现已证实化疗药物代谢酶基因的SNP改变是导致患者对化疗药物不同反应的原因之一。近年来,有学者发现dCK基因多态性及蛋白表达水平与核苷类药物的化疗敏感性密切相关。因此,本研究设计从不同来源人胰腺癌细胞株水平分析dCK基因多态性及蛋白表达与吉西他滨化疗敏感性间的关系,继而在胰腺癌临床患者中进行验证。以期建立通过dCK基因多态性及蛋白表达检测预测吉西他滨化疗疗效的方法,为胰腺癌患者的个体化化疗提供有效的预测指标。研究目的1.探讨胰腺癌细胞dCK基因多态性与吉西他滨化疗敏感性之间的关系；2.探讨胰腺癌细胞dCK蛋白表达水平与吉西他滨化疗敏感性之间的关系；3.探讨通过对胰腺癌患者dCK基因多态性及蛋白表达检测预测吉西他滨化疗疗效的可行性。实验方法第一部分,利用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits)提取6种人胰腺癌细胞株AsPC-1, BxPC-3, Mia PaCa2, SU86.86, SW1990, T3M4细胞的全DNA标本,PCR扩增目的片段后使用ABI3730XL基因分析仪进行dCK基因多态性检测；同时使用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂对上述细胞进行吉西他滨化疗敏感性检测,分析胰腺癌细胞dCK基因多态性与吉西他滨化疗敏感性间的关系；第二部分,在第一部分工作的基础上,各选取吉西他滨化疗敏感性不同的两组人胰腺癌细胞株(敏感组：BxPC-3, T3M4;不敏感组：AsPC-1, SW1990),进行dCK蛋白表达western blot检测并比较其差异；转染dCK-siRNA下调BxPC-3和T3M4细胞中dCK蛋白表达后,使用CCK-8试剂进行吉西他滨化疗敏感性检测,分析胰腺癌细胞dCK蛋白表达与胰腺癌吉西他滨化疗敏感性间的关系；第三部分,对30例吉西他滨化疗的胰腺癌患者外周血细胞DNA标本进行dCK基因多态性检测,分析胰腺癌患者dCK基因多态性与吉西他滨化疗预后的关系；对43例吉西他滨化疗的胰腺癌患者肿瘤组织标本进行dCK蛋白免疫组化检测,分析胰腺癌患者dCK蛋白表达与吉西他滨化疗预后的关系。研究结果1.在AsPC-1, BxPC-3, Mia PaCa2, SU86.86, SW1990, T3M4细胞中,检测到dCK基因A9846G和C300T两个SNP位点的基因型突变。CCK-8药敏检测显示：9846AG基因型细胞(BxPC-3, T3M4)较9846GG基因型细胞(AsPC-1, Mia PaCa2, SU86.86, SW1990)对吉西他滨化疗的反应更为敏感(P<0.01),300CT基因型细胞与300CC基因型细胞相比,吉西他滨化疗敏感性无显著性差异(P>0.01)；2.在AsPC-1, BxPC-3, SW1990, T3M4细胞中,dCK蛋白高表达组(BxPC-3和T3M4)较低表达组(AsPC-1和SW1990)的吉西他滨化疗敏感性更高(P<0.01)。使用dCK-siRNA下调BxPC-3和T3M4细胞中dCK蛋白表达后,BxPC-3和T3M4细胞的吉西他滨化疗敏感性明显下降(P<0.05)；3.30例胰腺癌患者中,dCK基因9846AA/AG基因型携带者较9846GG基因型携带者对吉西他滨化疗有更好的反应(P=0.057)；4.43例胰腺癌患者中,肿瘤组织dCK蛋白表达水平与患者的吉西他滨化疗预后呈正相关(P<0.05),与年龄呈负相关(P<0.05)。结论1.胰腺癌细胞dCK基因A9846G SNP位点的基因型与吉西他滨化疗敏感性密切相关；2.胰腺癌细胞dCK蛋白表达水平与吉西他滨化疗敏感性呈正相关；3.通过检测胰腺癌患者外周血细胞dCK基因多态性表型或肿瘤组织dCK蛋白表达水平预测胰腺癌患者吉西他滨化疗疗效的方法,具有较好的临床应用前景。