论文部分内容阅读
牛疱疹病毒1型(BHV-1)属疱疹病毒科,α疱疹病亚科成员,是有囊膜的双链DNA病毒。病毒粒子由外向里分为4层：囊膜、被膜、衣壳和核酸芯髓。BHV-1基因组总共编码70个左右基因,其中有10种为糖蛋白,6种为衣壳蛋白,15种为被膜蛋白。在长期的生物进化过程中,α疱疹病毒一直经由轴突微管逆行运输进入核内,最后在神经元细胞体建立终身潜伏感染。胞质动力蛋白由2条重链、2条中间链、多个轻中间链和轻链组成,其中重链由一个基因编码,其它部分则由多个基因编码。已有研究表明,HSV-1和PRV在侵染上皮细胞过程中,动力蛋白会结合其病毒衣壳蛋白进行运输。但是对BHV-1病毒粒子是否是依赖于微管进入核内没有报道,同时,BHV-1在运输到细胞核内过程中,病毒蛋白作用于动力蛋白具体的亚基也是未知的。因此,本文主要对胞质动力蛋白结合BHV-1病毒粒子进行初步研究,证实病毒进入上皮细胞MDBK时是否依赖于微管,并且试图找到与BHV-1相互作用的胞质动力蛋白亚基,为精确探究疱疹病毒感染宿主细胞机制奠定基础。主要工作包括：1.微管解聚药物试验首先对细胞牛肾传代细胞(MDBK)进行微管解聚药物Nocodazole最佳浓度摸索,得到的最适浓度为4μg/mL,然后采用此浓度药物作用于MDBK细胞,待药物作用2h后吸弃并洗净残留药物,用5MOI BHV-1野毒进行感染,在不同的时间点取样,利用间接免疫荧光对病毒粒子进行细胞内定位观察。结果显示微管解聚药物Nocodazole明显引起细胞内微管解聚,并且因此影响病毒进入的数量。为了进一步揭示病毒在药物影响下增殖情况,我们通过生长曲线实验,设置3个实验组,用药物处理细胞,在不同的时间点收毒,测定病毒PFU进行数据分析。结果显示,药物的作用延迟了病毒粒子进入到核内的时间；并且在较早的时间内,用药物处理的细胞中,由于微管的解聚导致重新聚合延迟,病毒粒子的增殖量较低。2.BHV-1病毒衣壳及被膜蛋白基因的克隆首先根据GenBank发表的BHV-1全基因组序列找到病毒的衣壳及被膜蛋白基因序列,其中衣壳基因6个,被膜基因15个。分析各基因的序列,将较大的基因根据其抗原位点进行截短,采取分段克隆。根据序列设计相应的引物,利用BHV-1病毒基因组作为模板,利用PCR扩增片段,回收并连接上pMD-18T载体,酶切验证并测序。利用生物信息学软件比对测序结果,得到正确的质粒,再将外源片段连接至pGAD-T7载体以备酵母双杂交。最后得到正确的质粒包括衣壳基因7个,被膜基因15个。3.酵母双杂交实验将胞质动力蛋白连接pGBK-T7质粒转化酵母菌AH109并作为钓饵。首先检测钓饵的自激活,其中Tctex1、Tctex3和C1I1-2连接pGBK-T7质粒转化后有自激活。将病毒蛋白基因转化酵母菌Y187,利用酵母GAL4系统进行酵母双杂交,以SV40/53, SV40/Lam二倍体作为杂交阳性及阴性对照,最后通过筛选189对蛋白得到初步结果,其中轻链Robll与被膜蛋白UL51有较弱的相互作用。