目的:胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,在我国居各类恶性肿瘤之首。近年来的研究表明,胃癌的发生发展是一个多基因参与的多阶段过程。因此,探讨胃癌的发病机制,寻找新的预防和治疗靶点以及有效的治疗药物,对降低胃癌发病率和死亡率,将有十分重要的意义。受体酪氨酸蛋白激酶(Receptor tyrosine kinase, RTK)是外界刺激信息传递至细胞核,转化成细胞效应的信号转导通路中的关键分子组成。EPH(erythropoietin-producing hepatocellular)基因家族是新发现的最大的RTK家族,而EphA2是该亚家族第三个发现并被克隆全长cDNA的成员,是该亚家族成员中被发现有酪氨酸激酶活性的第一个基因。在正常细胞,EphA2严格定位于上皮细胞膜表面的细胞间连接处,可与相邻细胞膜表面的配体EphrinA1结合后形成受体-配体复合物,继而激活胞浆的酪氨酸激酶而活化,参与胚胎发育、细胞迁移导向和血管形成等许多生理过程。EphA2正常表达时启动的信号转导途径抑制了Ras/MAPK的级联反应,削弱PDGF、EGF、VEGF等多种生长因子对MAPK的活化而抑制细胞的生长,并通过破坏细胞的灶状黏附对细胞粘附进行负调节。近年来EphA2在癌症发生发展中的作用越来越受到人们的关注。研究发现EphA2受体在许多肿瘤中有高表达和高活性,包括乳腺癌、大肠癌、前列腺癌及非小细胞肺癌,这些肿瘤细胞的生长、转化、转移与它的突变、过表达、异常定位或(和)异常活化有密切关系。因此,EphA2可能是一个肿瘤临床诊治的新靶点,但目前关于EphA2在胃癌中的异常表达尚缺乏详实的实验依据。格尔德霉素(Geldanamycin, GA)属于苯醌胺莎类抗生素,其作用靶点为热休克蛋白90(Heat Shock Protein, HSP90),为HSP90活性的抑制剂。HSP90是一组高度保守的分子伴侣,广泛存在于生物体中,在肿瘤细胞中异常高表达,其下游底物蛋白参与了肿瘤进展的所有关键环节。HSP90的底物蛋白种类繁多,包括甾体激素受体、苏氨酸激酶受体、酪氨酸激酶受体等,EphA2作为RTK家族一员很可能是HSP90下游的底物蛋白。近年来研究表明,格尔德霉素对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用,并能诱导细胞凋亡,已成为抗肿瘤新药研究的热点。但格尔德霉素对胃癌的抑瘤作用至今未见报道,且其对细胞周期的影响及促凋亡机制是否通过调节EphA2蛋白表达量来实现尚未阐明。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNAs, dsRNA )分子介导的序列特异性转录后基因沉默( post- transcriptional gene silencing, PTGS)过程,为dsRNA分子在mRNA水平上关闭相关基因表达的过程。目前,RNAi技术在人类基因功能研究和药物靶点鉴定等方面备受青睐,并且具有潜在的临床应用价值。为此,本研究探讨了EphA2及其配体EphrinA1在胃癌发生和发展中的表达情况及其与临床病理特征的关系,分析EphA2表达与胃癌细胞间粘附力、细胞增殖、细胞凋亡及血管形成的关系;观察HSP90抑制剂格尔德霉素对人胃癌细胞株MGC-803增殖和凋亡的影响,并通过检测EphA2、Survivin和Caspase-3下游蛋白表达,深入探讨EphA2是否是GA抗胃癌治疗的作用靶点;并应用RNAi技术沉默EphA2,观察人胃癌细胞株MGC-803的增殖情况,进一步阐明EphA2基因表达与胃癌形成的关系,以期为EphA2成为胃癌临床预防和治疗的新靶点提供理论依据,也为最终阐明胃癌发生和发展的分子机制奠定基础。方法:1 EphA2及其配体EphrinA1在胃癌、癌旁胃黏膜、手术切缘正常胃黏膜中的表达及意义采用免疫组织化学方法检测82例原发性胃癌组织、同个体的癌旁胃粘膜(距癌边缘2-5 cm)和手术切缘正常胃黏膜(距癌边缘5 cm以上,组织学上证实)组织中EphA2、EphrinA1和E-cadherin蛋白的表达,分析其表达与胃癌临床病理特征的关系;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western Blot技术对其中随机选取的30例标本进行EphA2 mRNA及其蛋白的定量检测。采用CD34抗体对82例癌组织标记微血管内皮细胞,计算微血管密度(MVD),分析EphA2表达与MVD之间的相关性,及它们与胃癌临床病理特征的关系;采用流式细胞术(FCM)检测82例癌组织中细胞凋亡率及增殖指数(PI),分析EphA2表达与细胞凋亡、增殖的关系;2研究格尔德霉素对人胃癌细胞株MGC-803增殖和凋亡的影响,探讨其调控EphA2表达的作用分子机制。常规培养人胃癌细胞系MGC-803。采用MTT法检测不同浓度的格尔德霉素(20、40、200、400、2000nmol/L)在12h、24h、48h及72h四个时间点对MGC-803细胞的增殖抑制作用;流式细胞术(FCM)测定细胞周期变化及细胞凋亡率;姬姆萨(Giemsa)染色法观察细胞形态学改变;免疫细胞化学染色法及流式细胞术分析EphA2、Survivin及Caspase-3蛋白的表达变化。3 RNAi沉默EphA2基因对人胃癌细胞株MGC-803增殖和凋亡的影响由武汉晶赛公司根据人EphA2基因序列转录RNA的位置及小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)设计原则,设计了3个靶位点,并构建了3个针对靶位点的一个载体编码一个小发夹状RNA(small hairpin RNA, shRNA)的质粒表达载体(S1、S2和S3),同时合成了一个阴性对照质粒表达载体(HK)。这些载体能表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)和具有新霉素(neomycin,neo)抗性。采用阳离子脂质体将它们转染入人胃癌MGC-803细胞;FCM、激光共聚焦显微镜观察转染效率,选择出阳离子脂质体和质粒表达载体最合适的比例;MTT观察转染效果最佳时间,用于后续实验;在转染后48h,分别采用RT-PCR和Western blot观察MGC-803细胞EphA2 mRNA和蛋白沉默效果,筛选出干扰效果最好的质粒表达载体,用于后续实验。采用干扰效果最好的质粒表达载体转染入MGC-803细胞后,观察EphA2表达、细胞增殖活性、细胞凋亡率及细胞周期的改变。结果:1不同病变胃组织EphA2蛋白及其配体EphrinA1的表达及与胃癌临床病理特征的关系免疫组化结果显示EphA2、EphrinA1蛋白表达强度:胃癌组明显高于癌旁组及正常胃粘膜组(P<0.01);中低分化组明显高于高分化组(P<0.05);深层浸润组明显高于浅层浸润组(P<0.05);淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组(P<0.05)。E-cadherin蛋白表达强度:胃癌组明显低于癌旁组和正常胃粘膜组(P<0.01);中低分化组明显低于高分化组(P<0.05);深层浸润组明显低于浅层浸润组(P<0.05);淋巴结转移组显著低于无淋巴结转移组(P<0.05)。EphA2与EphrinA1两者呈显著正相关(r=0.707, P<0.01);两种蛋白均与E-cadherin呈显著负相关(r=-0.231, r=-0.403, P<0.01)。RT-PCR结果显示EphA2 mRNA在各组中的表达水平无显著性差异(P>0.05),Western Blot与免疫组化结果一致。FCM结果显示EphA2高表达组细胞凋亡率显著低于低表达组(P=0.018),而其增殖指数(PI)显著高于低表达组(P=0.002)。胃癌组织中MVD显著高于癌旁组织及正常胃粘膜(P<0.01);MVD值与胃癌的分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关(P<0.05),MVD值还与肿瘤直径有关(P<0.05);EphA2表达与MVD呈显著正相关(r= 0.485, P<0.01)。2格尔德霉素(geldanamycin, GA)对人胃癌细胞株MGC-803增殖和凋亡的影响及调控EphA2等蛋白的表达各浓度组GA均可显著抑制MGC-803细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖关系,最大抑制率可达(77.69±0.91)%;GA作用48h后的IC50为558.94nmol/L;各浓度组GA均可阻滞MGC-803细胞于S期,诱导细胞凋亡率的显著升高(P<0.01);姬姆萨染色可见用药组细胞出现凋亡形态学改变:细胞核染色质浓缩、深染,可见核碎裂和凋亡小体;各浓度组GA可显著抑制EphA2、Survivin蛋白的表达,同时上调Caspase-3蛋白的表达(P<0.01)。3 RNAi沉默EphA2基因对人胃癌细胞MGC-803增殖和凋亡的影响当阳离子脂质体/质粒表达载体=2μl/1.0μg转染人胃癌MGC-803细胞时,转染效率能达到86.4%。MTT实验显示:转染后48h EphA2沉默效果最好。RT-PCR和Western Blot显示质粒载体S3对人胃癌MGC803细胞EphA2沉默的效果最好。EphA2表达沉默后抑制MGC-803细胞增殖,在48小时效果最好,随后逐渐下降。EphA2表达沉默后诱导MGC-803细胞凋亡,并可阻滞细胞进程,使G0/G1期细胞比例显著增加。结论:1首次联合检测EphA2、EphrinA1及E-cadherin蛋白在胃癌中的表达,证实EphA2在胃癌组织中异常高表达,并与胃癌浸润深度、分化程度降低及淋巴结转移密切相关。联合检测三种蛋白对胃癌转移、预后及恶性发展的监控具有重要意义。2 EphA2在胃癌组织中异常高表达,可抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,在胃癌的发生发展中发挥重要作用,其机制与EphA2 mRNA的转录异常无关,而可能是其翻译水平上调或蛋白质稳定性增高所致。3 EphA2在胃癌组织中的特异性高表达,可能参与肿瘤血管的生成,与胃癌的恶性进展具有密切关系。4首次报道格尔德霉素可抑制胃癌细胞增殖,阻滞细胞周期进程,诱导细胞凋亡,并进一步阐明其机制可能与下调EphA2等蛋白表达有关。5首次应用RNAi技术探讨EphA2表达在胃癌中的作用:EphA2基因沉默后,可抑制胃癌细胞的增殖,诱导其发生凋亡,提示EphA2有望成为预防胃癌发生和治疗胃癌的新靶点。