目的:哺乳动物的精子在进入女性生殖道后,需穿过宫颈,继续运动到子宫、输卵管,直至找到卵子完成受精。在这个过程中周围环境的渗透压逐步下降,低渗启动了精子一系列的信号转导。既往有关受精过程中伴随时不同位置的渗透压降低的研究主要关注于精子的容量调节性减少,未有学者系统地研究精子在外环境渗透压下降时的信号转导通路。本课题以低渗改变时人精子信号转导通路为研究对象,探讨钾离子通道KCNQ1/KCNE1在低渗变化时作用,阐释外环境渗透压改变对人精子的生理意义,并进一步推测低渗下精子的信号转导与部分男性不育症发生的联系。方法与结果:本课题按研究顺序分为五个部分。第一部分,目前还没有研究证实人精子膜上有KCNQ1/KCNE1通道,因此,证实它的在人精子膜上的存在是本研究的第一步。利用RT-PCR、WB、IP、等方法我们从RNA水平和蛋白水平鉴定KCNQ1/KCNE1在人精子中存在与定位,证实了KCNQ1/KCNE1在人精子膜上的存在;第二部分,细胞内外渗透压是影响细胞内外水平衡的重要因素,当细胞处于低渗环境时,细胞内水增加,细胞膨胀,与此同时,细胞启动容量调节机制,代偿性离子转运机制的激活使细胞内的离子外流,从而使细胞内的渗透压下降,细胞内的水外流,细胞体逐渐恢复,这个过程称为调节性细胞容量下降(RVD)。精子的RVD过程主要由钾离子通道、氯离子通道、水通道参与。我们采用流式细胞术(FCM)检测精子体积、钾离子荧光探针检测精子胞内钾离子浓度的实验方法,利用钾离子通道KCNQ1/KCNE1特异性抑制剂色原醇293B证实了 KCNQ1/KCNE1在人精子在低渗状态下的通道处于开放状态,介导钾离子外流,引起精子的细胞容量减少;第三部分,为了明确生理性的渗透压下降对精子的意义,我们从精子的运动、形态、胞内钙离子浓度的改变角度探讨低渗对精子的影响,实验结果证实精子的直线运动速率下降,卷尾率增加,证实了低渗对进入女性生殖道的精子有筛选作用。通过特异性抑制剂色原醇293B,我们发现当KCNQ1/KCNE1通道被阻滞时,精子参数变化更明显,这意味着低渗时钾离子通道KCNQ1/KCNE1通道的开放能够帮助精子对抗低渗引起的对活力不利的影响。钙成像的结果显示胞内钙离子浓度在低渗时上升,进一步通过胞外钙螯合剂的作用,我们发现胞内增加的钙离子主要来自于精子内的钙库。第四部分,在明确了钾离子通道在人精子低渗改变时开放的作用后,为了寻找该通道的上游调节机制,我们检测了人精子膜磷脂酰肌酰-4,5-二磷酸盐(PIP2)在低渗时的变化。PIP2在低渗时变现为先下降后上升,提示了在低渗应激早期PIP2的水解占主导地位,这与磷脂酶PLC的激活相关。用PLC阻滞剂U73122预处理精子后,精子胞内的钙离子和钾离子浓度不发生变化。这些结果提示在低渗应激时PLC被激活,水解PIP2生成三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG),IP3通过IP3受体激活了精子内钙库RNE释放内钙,引起胞内钙离子浓度增加。产生的DAG则可能通过激活蛋白激酶PKC引起KCNQ1/KCNE1通道的开放,介导低渗时胞内钾离子的外流。第五部分,为了进一步从电生理水平证实钾离子通道KCNQ1/KCNE1的低渗条件下的开放与PLC-PIP2-IP3/DAG通路相关,我们在HEK细胞上构建钾离子通道KCNQ1/KCNE1模型,利用膜片钳技术,证实了 KCNQ1/KCNE1在低渗下的开放,而PLC抑制剂U73122对低渗引起的钾离子通道KCNQ1/KCNE1的开放起抑制作用。结论:人精子在低渗状态下会激活细胞膜上的磷脂信号转导系统,钾离子通道KCNQ1/KCNE1的开放则与PLC的激活相关,KCNQ1/KCNE1开放后钾离子外流可减少细胞容量,对抗低渗对精子活力的不利影响,而在此过程中钙库释放的钙离子也为精子的获能提供了离子基础。