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长期以来,植物病害严重威胁着我国的农业生产。相较于传统的化学农药而言,微生物杀菌剂更符合当代人们对于健康环保及农业生产可持续发展的要求。杨凌糖丝菌Hhs.015是本实验室前期分离获得的一株生防放线菌,它对苹果树腐烂病菌等多种病原菌均具有良好的抑制效果。前期研究表明杨凌糖丝菌Hhs.015具有较强的几丁质酶活性,几丁质酶可以有效降解病原真菌细胞壁中的重要成分——几丁质,从而抑制病原菌的生长或致其死亡。因此,对于杨凌糖丝菌Hhs.015几丁质酶的研究,一方面可以确定几丁质酶是否参与杨凌糖丝菌Hhs.015的生防反应,以进一步探究杨凌糖丝菌Hhs.015的抑菌作用机理,另一方面,通过基因工程克隆几丁质酶基因,为优良生防工程菌株的构建奠定基础。1.本研究通过对杨凌糖丝菌菌株Hhs.015全基因组序列分析和预测,获得了8个编码几丁质酶基因的序列,分别命名为Chi3249、Chi3770、Chi4882、Chi5114、Chi5676、Chi6195、Chi6196和Chi6769。其序列长度在1077~2233 bp之间,编码351~729个氨基酸,预测蛋白分子量在37.4~77.9 KDa之间。序列比对发现,8个几丁质酶氨基酸序列均和糖丝菌属菌种相似度最高,亲缘关系较近的菌株包括Saccharothrix sp.NRRL B-16314、Saccharothrix sp.NRRL B-16348、Saccharothrix espanaensis DSM44229及Saccharothrix syringae,相似度多在90%左右,但Chi6769与Saccharothrix syringae同源性仅为79%。通过对8个氨基酸序列分析发现,Chi3249、Chi3770、Chi5114、Chi5676、Chi6195、Chi6769蛋白具有信号肽序列,长度为20~42个氨基酸。保守域分析发现其均存在几丁质催化域,个别存在几丁质结合域(CBD)。通过对其进行结构预测,8个蛋白的二级结构均以helix、strand和loop为主,高级结构则都包含α/β组成的桶状结构。2.通过构建pET-Chi6769表达载体,将其导入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,并对其诱导条件进行优化,通过SDS-PAGE检测发现,重组蛋白p ET-Chi6769在18℃振荡培养,IPTG浓度为0.5 mmol/L时表达量最高,诱导时间在8~20 h时对其影响不大。通过皿内对峙发现,Chi6769对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)具有较强的抑制作用,可致使其菌丝分枝增多、聚集等。3.本研究为了验证几丁质酶是否参与杨凌糖丝菌Hhs.015的生防反应,拟对其进行敲除,首要步骤是建立其遗传转化体系。利用接合转移的方法,将整合型质粒p SET152成功转入杨凌糖丝菌Hhs.015中,并优化了接合转移条件,确定了最适条件为:受体菌杨凌糖丝菌Hhs.015孢子40℃热激10 min,与供体菌E.coli ET12567/(p UZ8002、p SET152)以1:1的比例接合,以MS为接合培养基,接合18~20 h后转移至含安普霉素5μg/mL、萘啶酮酸25μg/mL的2CMY筛选培养基。