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近年来,随着我国畜牧业的集约型发展,禽畜粪便的处理问题不容忽视。厌氧发酵产氢-产甲烷技术已成为人们处理纤维素类有机物的一条有效途径,在此过程中不但获取了清洁能源,而且还解决了有机废弃物所引起的环境问题,具有能源和环境的双重意义。但以新鲜牛粪为底物产氢-产甲烷两步发酵技术的研究却鲜有报道。本论文尝试以新鲜牛粪作为牲畜粪便的模型物构建了产氢-产甲烷两步发酵体系。首先对新鲜牛粪发酵产氢参数进行优化,并在单因素的基础上应用响应面分析法对发酵产氢体系进行中心组合实验,确定污泥利用新鲜牛粪发酵产氢的最佳条件。对新鲜牛粪产氢-产甲烷两步发酵系统和一步产甲烷系统在气体产量、能源回收率和底物成分等方面性能进行对比,并从分子生物学角度对发酵过程中不同阶段的群落特征进行分析,具体的研究结果如下:1.驯化得到了能够直接利用微晶纤维素的产氢菌。高通量测序结果表明厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）为其中的优势菌群。2.分别考察了接种菌源、初始pH值、铁粉添加量、生物强化剂用量及C/N比对新鲜牛粪发酵产氢的影响。结果表明,在污泥为接种菌源、初始pH 5.0、铁粉添加量600mg/L、生物强化剂用量8%及C/N比24时获得最大产氢量和氢浓度分别为55.19mL/g-TVS和31.4%。采用Box-Benhnken试验设计及响应面法对氢发酵的重要参数进行了优化,结果表明,当初始pH值为5.95,C/N比为25.2和生物强化剂添加量为8.32%时,最大的理论产氢量为59.94 mL/g-TVS,实际产氢量为59mL/g-TVS。高通量测序和变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术测试结果表明生物强化剂处理的样品呈现生物多样性,其中梭菌Clostridium sp.的数量显著增加。3.考察并优化了新鲜牛粪两阶段发酵联产氢气-甲烷的过程参数,在最佳条件下得到氢气和甲烷的最大产量分别为59.85m L H2/g-TVS和447.3mL CH4/g-TVS。C/N比重要的影响牛粪厌氧消化阶段甲烷的产量,与对照样相比,甲烷产量从93ml CH4/g-TVS增加至223.9 m L CH4/g-TVS。通过两阶段发酵,废水COD去除率和总的能源回收率分别达到78%和44.06%,比单独厌氧消化阶段分别提高了13.42%和10.7%。4.高通量测序和PCR-DGGE技术的测试结果表明:在新鲜牛粪氢发酵阶段,氢发酵介质中随着发酵时间的增加,发酵液中物种总数和群落多样性先增加后减少,Clostridiales和Coriobacteriales数量急剧增加。在厌氧消化产甲烷阶段,微生物多样性先增强后降低,厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为产甲烷过程的优势群落,螺旋菌门（Spirochaetae）、互养菌门（Synergistetes）和绿弯菌门（Chloroflexi）是产甲烷阶段的新增菌群。