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目的：
建立SD雄性大鼠肾精亏虚模型，以骨髓造血干细胞为切入点，观察其凋亡情况，研究肾精亏虚对骨髓造血功能的影响，探讨其作用机制。观察龟鹿二仙胶对肾精亏虚骨髓抑制性贫血大鼠的治疗效果，通过其对大鼠的血象、骨髓象以及骨髓造血干细胞凋亡的影响，分析其“从肾论治”治疗肾精亏虚引起的骨髓抑制性贫血的作用机制。
方法：
1、理论研究：系统回顾古今文献，阐述肾精、髓、血的中医理论研究及现代医学研究，立足肾精、髓以及血之间的关系，为肾精亏虚导致贫血提供中医理论依据。剖析龟鹿二仙胶的组方以及总结补肾填精法的现代医学临床应用。
2、动物实验：SD雄性大鼠30只，SPF级，8周龄，体重270±20g，随机分为空白组、模型组、补肾组，每组10只。采用模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓以及长期小剂量苯皮下注射和短期大剂量环磷酰胺腹腔注射，建立肾精亏虚大鼠模型。整个造模过程用时49天。前4周模型组和补肾组大鼠按体质量皮下隔天注射苯（lmL/kg），第25d开始用环磷酰胺（25mg/kg）腹腔注射，连续注射3d，同时每天用仿地震平台模拟地震振动（2次/日，共15-20分钟）以及光电刺激箱足底电击刺激（每日不定时1-3次）。空白组正常喂养。在第4周最后一天随机抽取模型组和补肾组各1只大鼠查外周血象及血清睾酮，检测模型是否成功。第29天开始，补肾组用龟鹿二仙胶灌胃，根据大鼠与人体表面积折算剂量比值，灌胃剂量为11g/Kg，分两次灌胃。给药期间每隔一天称重，根据体重调整给药剂量，连续21天。模型组和空白组大鼠给予等量去离子水灌胃，连续21天。造模过程中，每天观察各组大鼠的皮毛、进食量、活动状态等一般情况。造模结束后，每组大鼠通过眼内眦静脉取血法测外周静脉血红细胞（RBC）和血红蛋白（HGB），观察其贫血程度；采用ELISA检测血清睾酮T以及用精子分析仪检测附睾精子质量，评价其生殖功能；取睾丸组织包埋切片，HE染色，观察其形态学的改变；分离胫骨，取新鲜骨髓，用PBS制备单细胞悬液，采用血红细胞计数板计数单核细胞数；取新鲜骨髓，制成骨髓涂片，瑞氏-吉姆萨染色,观察骨髓细胞的形态学改变；股骨包埋、切片，HE染色，观察骨髓增生情况；取新鲜骨髓包埋超薄切片，观察其超微病理改变。采用ELISA法检测各组EPO的含量；用流式细胞仪以及TUNEL法检测各组大鼠骨髓组织CD34+细胞凋亡情况；采用WB法检测各组大鼠骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白含量；采用RT-PCR法检测各组大鼠骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和FaslmRNA的表达水平。
3、统计学处理：各组组间进行比较，所得数据均以均数±标准差（(x)±s）表示，采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，单因素方差分析组间比较，采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果：
①与正常组相比，模型组大鼠出现毛发干枯、耸立不齐、进食量下降，活动度减少等现象。补肾组大鼠毛发恢复光泽、进食量增加、活动度增加，肾虚症状得到改善。
②与空白组比较，模型组血红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量从14d开始下降，有显著性差异（p＜0.01）；与模型组比较，补肾组血红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量从42d开始升高，有显著性差异（p＜0.05）。
③与空白组比较，模型组血清EPO含量下降，有显著性差异（P＜0.01）；与模型组比较，补肾组血清EPO含量升高，有显著性差异（P＜0.01）。
④睾丸病理切片显示，空白组睾丸曲细精管被膜完整，支持细胞形态正常，曲细精管管腔内可见大量精子；模型组曲细精管生精上皮明显变薄,细胞层次杂乱,支持细胞形态断裂，曲细精管管腔内精子细胞、精子数量明显减少；补肾组曲细精管被膜完整，细胞排布紧密,生精细胞数略有减少,部分区域可见脱落的少量生精细胞,但结构清楚,层次较分明，管腔内有较多精子。
⑤与空白组比较，模型组附睾精子浓度及精子活力均下降（P＜0.05）；模型组血清T含量明显下降（P＜0.01）；与模型组比较，补肾组附睾精子浓度及精子活力均明显升高（P＜0.01），补肾组血清T含量升高，有显著性差异（P＜0.01）。
⑥骨髓象显示，与空白组比较，模型组骨髓有核细胞数量减少（P＜0.05）；与模型组比较补肾组骨髓有核细胞数量增加，有显著性差异（P＜0.05）。骨髓涂片可见空白组骨髓造血结构完整，组织丰富；模型组骨髓增生降低，巨核细胞减少；补肾组造血网织红细胞虽增加，但仍没有恢复正常水平。骨髓病理切片显示：空白组造血细胞多且分布均匀，骨髓造血组织支架结构紧密，脂肪细胞数量少；模型组造血组织面积减少,巨核细胞少见,造血细胞数目减少,内皮细胞、脂肪细胞等非造血细胞数目增多；补肾组造血结构组织基本修复，巨核细胞增多，造血细胞增加，仍可见脂肪细胞等非造血细胞。
⑦骨髓超微病理形态学检测示：空白组大鼠可见造血干细胞为圆形，单核，核大，细胞质少，可见线粒体，线粒体内膜折叠成较深的嵴。模型组大鼠造血干细胞可见线粒体数量减少，嵴变浅或消失，线粒体肿胀，可见凋亡小体。补肾组大鼠造血干细胞有核细胞增多，凋亡小体少见，线粒体的数量增多，线粒体嵴有所恢复。
⑧与空白组比较，骨髓石蜡包埋切片TUNEL法检测发现模型组可见较多凋亡CD34+细胞的绿色荧光点，流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞凋亡的数量明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，补肾组石蜡包埋切片TUNE L法检测骨髓组织绿色荧光点数量减少，流式细胞仪检测CD34+细胞凋亡的数量降低（P＜0.05）。
结论：
“肾藏精，生髓，化血”，肾藏先天之精，肾气促脾胃化生水谷精微而藏之，而“精血同源”，肾精是化生血液的重要物质基础。肾精亏虚则血液化生无源而导致血虚。肾主人体发育，也主骨髓生长发育，肾精充足，则骨髓充盈，反之肾精不足，骨髓空虚。骨髓具有化生血液的作用，髓化生血液主要取决于肾的功能，肾精亏虚则会导致骨髓功能低下，化生血液出现障碍而致血虚。
本课题基于中医“肾藏精、精生髓，髓生血，精化血”理论，以肾精亏虚则会导致血虚为实验的病理依据，以造血干细胞作为切入点。研究肾精亏虚对造血功能的影响及其作用机制。以“恐伤肾”传统病因造模结合药物干预病理造模，采用模拟地震平台复合光电刺激法结合长期小剂量的苯和短期大剂量的环磷酰胺药物干预，建立肾精亏虚大鼠模型。大鼠出现肾虚症状，血液检查可以看到血红细胞数量和血红蛋白含量降低，血清EPO含量下降，血清睾酮含量降低。骨髓象可以见到骨髓有核细胞数量减少，骨髓造血组织结构疏松、造血面积减少、造血细胞减少。超微病理形态学可以观察到骨髓造血干细胞线粒体肿胀，线粒体嵴变浅，出现凋亡小体的超微病理改变。
龟鹿二仙胶灌胃治疗后，能够改善肾精亏虚的症状，促进血红细胞数量和血红蛋白含量增高，血清EPO含量升高，血清睾酮含量增加，骨髓有核细胞数量增加，骨髓造血组织得到修复。骨髓造血干细胞线粒体数量增加，凋亡小体减少，减少骨髓CD34+细胞的凋亡。
本实验结论归纳如下：
①利用“仿地震平台及光电刺激+苯+环磷酰胺”成功建立肾精亏虚雄性大鼠模型。
②肾精亏虚大鼠血清EPO含量下降，骨髓组织抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白、Bcl-2mRNA含量下降，促凋亡蛋白Bax蛋白及BaxmRNA表达增加，激活了线粒体/细胞色素c通路，发生级联效应，激活Caspase-3蛋白，诱导骨髓CD34+细胞的凋亡。骨髓Fas和Fasl蛋白及Fas和FaslmRNA含量升高，激活了死亡受体途径，激活Caspase-3蛋白，诱导CD34+细胞细胞的凋亡。CD34+细胞过度凋亡，骨髓造血干细胞活性降低，可能是肾精亏虚导致骨髓抑制影响骨髓造血功能的机制之一。
③首次采用龟鹿二仙胶治疗肾精亏虚，改善骨髓造血功能。龟鹿二仙胶能有效缓解肾精亏虚大鼠的症状，治疗骨髓抑制性贫血有效。提高血清EPO含量，促进抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达，抑制促凋亡蛋白Bax蛋白、Fas和Fasl蛋白的表达，减少Caspase-3蛋白的表达，抑制CD34+细胞的凋亡，从而保护造血干细胞。刺激骨髓造血干细胞的增殖，避免其发生过度凋亡，可能是龟鹿二仙胶发挥其疗效机制之一。
④从生成来源和生物学功能来看，EPO可能是肾精的物质基础之一。
⑤造血干细胞是肾精在细胞层次的表现形式，是“肾精化血”功能的执行者。
建立SD雄性大鼠肾精亏虚模型，以骨髓造血干细胞为切入点，观察其凋亡情况，研究肾精亏虚对骨髓造血功能的影响，探讨其作用机制。观察龟鹿二仙胶对肾精亏虚骨髓抑制性贫血大鼠的治疗效果，通过其对大鼠的血象、骨髓象以及骨髓造血干细胞凋亡的影响，分析其“从肾论治”治疗肾精亏虚引起的骨髓抑制性贫血的作用机制。
方法：
1、理论研究：系统回顾古今文献，阐述肾精、髓、血的中医理论研究及现代医学研究，立足肾精、髓以及血之间的关系，为肾精亏虚导致贫血提供中医理论依据。剖析龟鹿二仙胶的组方以及总结补肾填精法的现代医学临床应用。
2、动物实验：SD雄性大鼠30只，SPF级，8周龄，体重270±20g，随机分为空白组、模型组、补肾组，每组10只。采用模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓以及长期小剂量苯皮下注射和短期大剂量环磷酰胺腹腔注射，建立肾精亏虚大鼠模型。整个造模过程用时49天。前4周模型组和补肾组大鼠按体质量皮下隔天注射苯（lmL/kg），第25d开始用环磷酰胺（25mg/kg）腹腔注射，连续注射3d，同时每天用仿地震平台模拟地震振动（2次/日，共15-20分钟）以及光电刺激箱足底电击刺激（每日不定时1-3次）。空白组正常喂养。在第4周最后一天随机抽取模型组和补肾组各1只大鼠查外周血象及血清睾酮，检测模型是否成功。第29天开始，补肾组用龟鹿二仙胶灌胃，根据大鼠与人体表面积折算剂量比值，灌胃剂量为11g/Kg，分两次灌胃。给药期间每隔一天称重，根据体重调整给药剂量，连续21天。模型组和空白组大鼠给予等量去离子水灌胃，连续21天。造模过程中，每天观察各组大鼠的皮毛、进食量、活动状态等一般情况。造模结束后，每组大鼠通过眼内眦静脉取血法测外周静脉血红细胞（RBC）和血红蛋白（HGB），观察其贫血程度；采用ELISA检测血清睾酮T以及用精子分析仪检测附睾精子质量，评价其生殖功能；取睾丸组织包埋切片，HE染色，观察其形态学的改变；分离胫骨，取新鲜骨髓，用PBS制备单细胞悬液，采用血红细胞计数板计数单核细胞数；取新鲜骨髓，制成骨髓涂片，瑞氏-吉姆萨染色,观察骨髓细胞的形态学改变；股骨包埋、切片，HE染色，观察骨髓增生情况；取新鲜骨髓包埋超薄切片，观察其超微病理改变。采用ELISA法检测各组EPO的含量；用流式细胞仪以及TUNEL法检测各组大鼠骨髓组织CD34+细胞凋亡情况；采用WB法检测各组大鼠骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白含量；采用RT-PCR法检测各组大鼠骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和FaslmRNA的表达水平。
3、统计学处理：各组组间进行比较，所得数据均以均数±标准差（(x)±s）表示，采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，单因素方差分析组间比较，采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果：
①与正常组相比，模型组大鼠出现毛发干枯、耸立不齐、进食量下降，活动度减少等现象。补肾组大鼠毛发恢复光泽、进食量增加、活动度增加，肾虚症状得到改善。
②与空白组比较，模型组血红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量从14d开始下降，有显著性差异（p＜0.01）；与模型组比较，补肾组血红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量从42d开始升高，有显著性差异（p＜0.05）。
③与空白组比较，模型组血清EPO含量下降，有显著性差异（P＜0.01）；与模型组比较，补肾组血清EPO含量升高，有显著性差异（P＜0.01）。
④睾丸病理切片显示，空白组睾丸曲细精管被膜完整，支持细胞形态正常，曲细精管管腔内可见大量精子；模型组曲细精管生精上皮明显变薄,细胞层次杂乱,支持细胞形态断裂，曲细精管管腔内精子细胞、精子数量明显减少；补肾组曲细精管被膜完整，细胞排布紧密,生精细胞数略有减少,部分区域可见脱落的少量生精细胞,但结构清楚,层次较分明，管腔内有较多精子。
⑤与空白组比较，模型组附睾精子浓度及精子活力均下降（P＜0.05）；模型组血清T含量明显下降（P＜0.01）；与模型组比较，补肾组附睾精子浓度及精子活力均明显升高（P＜0.01），补肾组血清T含量升高，有显著性差异（P＜0.01）。
⑥骨髓象显示，与空白组比较，模型组骨髓有核细胞数量减少（P＜0.05）；与模型组比较补肾组骨髓有核细胞数量增加，有显著性差异（P＜0.05）。骨髓涂片可见空白组骨髓造血结构完整，组织丰富；模型组骨髓增生降低，巨核细胞减少；补肾组造血网织红细胞虽增加，但仍没有恢复正常水平。骨髓病理切片显示：空白组造血细胞多且分布均匀，骨髓造血组织支架结构紧密，脂肪细胞数量少；模型组造血组织面积减少,巨核细胞少见,造血细胞数目减少,内皮细胞、脂肪细胞等非造血细胞数目增多；补肾组造血结构组织基本修复，巨核细胞增多，造血细胞增加，仍可见脂肪细胞等非造血细胞。
⑦骨髓超微病理形态学检测示：空白组大鼠可见造血干细胞为圆形，单核，核大，细胞质少，可见线粒体，线粒体内膜折叠成较深的嵴。模型组大鼠造血干细胞可见线粒体数量减少，嵴变浅或消失，线粒体肿胀，可见凋亡小体。补肾组大鼠造血干细胞有核细胞增多，凋亡小体少见，线粒体的数量增多，线粒体嵴有所恢复。
⑧与空白组比较，骨髓石蜡包埋切片TUNEL法检测发现模型组可见较多凋亡CD34+细胞的绿色荧光点，流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞凋亡的数量明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，补肾组石蜡包埋切片TUNE L法检测骨髓组织绿色荧光点数量减少，流式细胞仪检测CD34+细胞凋亡的数量降低（P＜0.05）。
结论：
“肾藏精，生髓，化血”，肾藏先天之精，肾气促脾胃化生水谷精微而藏之，而“精血同源”，肾精是化生血液的重要物质基础。肾精亏虚则血液化生无源而导致血虚。肾主人体发育，也主骨髓生长发育，肾精充足，则骨髓充盈，反之肾精不足，骨髓空虚。骨髓具有化生血液的作用，髓化生血液主要取决于肾的功能，肾精亏虚则会导致骨髓功能低下，化生血液出现障碍而致血虚。
本课题基于中医“肾藏精、精生髓，髓生血，精化血”理论，以肾精亏虚则会导致血虚为实验的病理依据，以造血干细胞作为切入点。研究肾精亏虚对造血功能的影响及其作用机制。以“恐伤肾”传统病因造模结合药物干预病理造模，采用模拟地震平台复合光电刺激法结合长期小剂量的苯和短期大剂量的环磷酰胺药物干预，建立肾精亏虚大鼠模型。大鼠出现肾虚症状，血液检查可以看到血红细胞数量和血红蛋白含量降低，血清EPO含量下降，血清睾酮含量降低。骨髓象可以见到骨髓有核细胞数量减少，骨髓造血组织结构疏松、造血面积减少、造血细胞减少。超微病理形态学可以观察到骨髓造血干细胞线粒体肿胀，线粒体嵴变浅，出现凋亡小体的超微病理改变。
龟鹿二仙胶灌胃治疗后，能够改善肾精亏虚的症状，促进血红细胞数量和血红蛋白含量增高，血清EPO含量升高，血清睾酮含量增加，骨髓有核细胞数量增加，骨髓造血组织得到修复。骨髓造血干细胞线粒体数量增加，凋亡小体减少，减少骨髓CD34+细胞的凋亡。
本实验结论归纳如下：
①利用“仿地震平台及光电刺激+苯+环磷酰胺”成功建立肾精亏虚雄性大鼠模型。
②肾精亏虚大鼠血清EPO含量下降，骨髓组织抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白、Bcl-2mRNA含量下降，促凋亡蛋白Bax蛋白及BaxmRNA表达增加，激活了线粒体/细胞色素c通路，发生级联效应，激活Caspase-3蛋白，诱导骨髓CD34+细胞的凋亡。骨髓Fas和Fasl蛋白及Fas和FaslmRNA含量升高，激活了死亡受体途径，激活Caspase-3蛋白，诱导CD34+细胞细胞的凋亡。CD34+细胞过度凋亡，骨髓造血干细胞活性降低，可能是肾精亏虚导致骨髓抑制影响骨髓造血功能的机制之一。
③首次采用龟鹿二仙胶治疗肾精亏虚，改善骨髓造血功能。龟鹿二仙胶能有效缓解肾精亏虚大鼠的症状，治疗骨髓抑制性贫血有效。提高血清EPO含量，促进抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达，抑制促凋亡蛋白Bax蛋白、Fas和Fasl蛋白的表达，减少Caspase-3蛋白的表达，抑制CD34+细胞的凋亡，从而保护造血干细胞。刺激骨髓造血干细胞的增殖，避免其发生过度凋亡，可能是龟鹿二仙胶发挥其疗效机制之一。
④从生成来源和生物学功能来看，EPO可能是肾精的物质基础之一。
⑤造血干细胞是肾精在细胞层次的表现形式，是“肾精化血”功能的执行者。