家蚕作为一种完全人工驯化的经济昆虫,拥有良好的饲养体系和遗传繁殖体系,其个体适中,已被认为是研究鳞翅目昆虫理想的模式生物之一。2004年家蚕基因组测序完成,大量的序列信息得到注释。结合家蚕cDNAs序列,构建了家蚕理论蛋白质库,为家蚕蛋白质组学研究提供了检索数据库。昆虫表皮是覆盖机体的细胞外结构,是虫体直接与外在环境接触的界面,行使多种生物学功能。为昆虫提供有效的保护,以抵御环境中有害因素的影响；提供可变的机械性能,营造昆虫发育的最优环境。昆虫表皮主要由几丁质和蛋白质基质组成。表皮蛋白和几丁质通过自我组装形成复合物的超高级结构,这种结构是昆虫表皮行使功能的基础。序列分析发现与几丁质结合的蛋白质即使在不同物种中,仍然拥有较保守的结构域,且在表皮中扮演着重要的角色,其中主要的是由Rebers和Riddiford发现的“R&R”共有序列。研究证实了具有“R&R”结构域的表皮蛋白能与几丁质结合。而体外表达实验却发现具有CPF结构域的表皮蛋白不能与几丁质结合。本实验利用强阴离子去污剂SDS抽提家蚕幼虫表皮中难溶的几丁质结合蛋白。透析去除SDS后,将得到的蛋白质样品用于体外结合实验,分离得到与几丁质结合的蛋白质组分。进一步采用LC-MS/MS串联质谱进行鉴定。在检测得到的90个可信肽段中,85个肽段匹配得到22个蛋白质。其中有38个肽段指向9个预测的表皮蛋白,平均覆盖度约为23%。这些表皮蛋白包括7个RR-1蛋白、一个Tweedle蛋白、一个RR-3蛋白。除了表皮蛋白外,本实验还鉴定了13个其它蛋白,包括2个溶菌酶、2个具有Ⅱ型几丁质结构域的蛋白、2个ATP合成酶以及30K蛋白、载脂蛋白Ⅲ、脂肪酶、启动蛋白肽酶类似蛋白、肌肉蛋白20、和未知功能蛋白。根据质谱鉴定数据,选取两个分别具有RR-1和Tweedle结构域的蛋白质BmorCPR56和BmorCPT1基因用于原核表达,模拟天然蛋白进行体外结合实验。使用特异的引物扩增得到501 bp的BmorCPR56和1383 bp的BmorCPT1 cDNA序列。然后分别将它们插入PGEX-4T-1载体,位于编码GST序列之后,并测序确认。以大肠杆菌BL21 (DE3)作为表达菌株,IPTG诱导表达目的蛋白。经超声波破碎菌体释放目蛋白,并用GST亲和层析进一步纯化得到目的蛋白。原核表达BmorCPR56的成熟肽为166个氨基酸,BmorCPR56-GST融合蛋白的分子量约为45 kDa。BmorCPT1蛋白的成熟肽有460个氨基酸,BmorCPT1-GST融合蛋白的分子量约为77 kDa。Rebers和Willis报道了GST表达序列标签不能与几丁质结合,因而GST标签将不会影响靶标蛋白的儿丁质结合分析。本实验能很好的展现BmorCPR56和BmorCPT1蛋白能够与几丁质结合,首次直接证明Tweedle蛋白为几丁质结合蛋白。