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第一部分PKM2调节糖酵解和细胞外基质沉积促进CTEPH血管重构背景和目的肺血管重构是慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)的重要病理生理机制,表现为内膜增厚和细胞外基质异常沉积。丙酮酸激酶M2(PKM2)是细胞糖酵解途径最后一步的限速酶,通常在增殖细胞和肿瘤细胞中过表达,调节糖酵解进程和Warburg效应。有研究显示糖代谢异常在动脉性肺动脉高压中有重要作用,但在CTEPH中尚缺少相关研究,CTEPH患者肺动脉细胞糖代谢的方式尚不明确。本研究拟探讨PKM2在CTEPH患者肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)糖酵解和细胞外基质沉积中的作用。方法1.收集CTEPH患者肺动脉血栓内膜剥脱术(PEA)组织标本,Masson染色观察胶原是否异常分布;采用实时荧光定量PCR的方法检测CTEPH患者PEA组织中细胞外基质代谢标志物基质金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9的表达;采用免疫组织化学方法对PEA组织中的TIMP1、MMP2、MMP9进行半定量检测。2.采用实时荧光定量PCR的方法检测CTEPH患者PEA组织中糖酵解途径相关基因的表达;采用免疫组织化学方法对PEA组织中PKM1、PKM2的蛋白表达进行半定量。3.分离、培养并鉴定CTEPH患者PASMCs。4.应用海马能量代谢仪检测PASMCs的能量代谢情况和糖酵解水平。5.采用实时荧光定量PCR方法和Western blot方法检测PASMCs中PKM2、TIMP1、MMP2、I型胶原的表达水平。6.采用siRNA干扰的方法敲减PASMCs的PKM2表达,检测敲减PKM2后PASMCs糖酵解水平。7.采用siRNA干扰和PKM2激活剂TEPP46刺激患者PASMCs,细胞的增殖能力采用CCK8法检测,细胞的迁移能力采用划痕愈合实验检测。8.采用siRNA干扰患者PASMCs,采用实时荧光定量PCR法和蛋白印迹方法检测siRNA干预后细胞外基质标志物的表达。结果1.CTEPH患者PEA组织存在胶原异常沉积,TIMP1的表达较肺移植供体肺动脉组织表达增高,MMP2、MMP9变化无显著差异。CTEPH患者PEA组织中糖酵解相关基因PKM2、乳酸脱氢酶A(lactatedehydrogenaseA,LDHA)、己糖激酶2(hexokinase2,HK2)的表达增高,PKM1无显著差异。2.CTEPH患者PASMCs糖酵解水平较正常PASMCs增高。CTEPH患者PASMCs糖酵解相关基因PKM2、LDHA、单羧酸转运蛋白4(monocarboxylate transporter 4,MCT4)、低氧诱导因子 1α(hypoxiainducible factor 1α,HIF1α)较正常 PASMCs表达增高。患者PASMCs在PKM2敲减后观察到糖酵解水平下降,线粒体氧化磷酸化水平增加,糖酵解相关指标LDHA、HK2表达下降;正常PASMCs的PKM2敲减后能量代谢方式未见变化。3.PKM2敲减可抑制患者PASMCs的增殖和迁移能力;PKM2激活剂TEPP46刺激可增强患者PASMCs的增殖和迁移能力。4.CTEPH患者PASMCs细胞外基质代谢异常,TIMP1、Ⅰ型胶原表达增高,MMP2无显著差异。PKM2敲减可抑制患者PASMCs细胞外基质代谢标志物TIMP1的表达,细胞外基质Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达也下调。结论研究表明CTEPH患者肺动脉中存在糖酵解水平增加和细胞外基质代谢异常。CTEPH患者肺动脉中PKM2、TIMP1表达增加。PKM2可调节CTEPH患者PASMCs中糖酵解水平和细胞外基质的沉积,敲减PKM2可抑制患者PASMCs糖酵解水平和细胞外基质生成。研究可能为CTEPH的治疗提供一个潜在靶点。第二部分慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型构建的初步研究背景及目的迄今为止,慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)的病理生理机制尚未完全阐明,CTEPH的治疗仍面临很多挑战。但由于缺乏成熟的动物模型,转化医学研究进展缓慢。因此,需要构建操作简便、实用、并能客观模拟临床CTEPH发生发展的动物模型。本研究旨在初步探索血管内皮生长因子受体抑制剂Sugen5416联合多次自体血栓注入的大鼠模型构建,为CTEPH小动物模型构建提供思路。方法1.6-8周龄雄性SD大鼠,随机分成5组,每组3只:对照组(Ctrl组,注入等体积生理盐水)、注栓6h组、注栓12h组、注栓24h组、注栓48h组。经大鼠内眦取血制备自体血栓,经左侧颈静脉注栓后分别于相应时间点处死取材。取肺组织进行HE染色,观察不同时间点自体血栓溶解情况。2.6-8周龄雄性SD大鼠,随机分为4组,每组8-12只:对照组(Ctrl组,注入等体积生理盐水)、自体血栓注入组(PE组)、Sugen5416给药组(SU组)、Sugen5416联合自体血栓注入组(PE+SU组)。SU组和PE+SU组于首次注栓前1天予Sugen5416 20mg/kg单剂量腹腔注射。PE组和PE+SU组于实验第1天、第3天、第5天经左侧颈静脉进行三次自体血栓注入,同时在造模初始2周每天进行抗纤溶剂氨甲环酸(315mg/kg/d)腹腔注射。第5周末测量各组大鼠肺动脉压力(mPAP)、肺小动脉中膜厚度百分比(MT%)、右心室肥厚指数(RVHI)评估造模情况。用免疫组织化学的方法检测各组大鼠肺小动脉中α-SMA、PKM1、PKM2的表达水平。结果1.首次注栓后12h大鼠肺动脉干及叶肺动脉血栓有溶解;24h血栓逐渐溶解至初始注入血栓体积的50%,48h后注入的自体血栓几乎完全溶解。2.与对照组、PE组、SU组相比,PE+SU组mPAP明显升高[(27.96±4.53)mmHg vs(14.59±2.51)mmHg,(17.67±2.99)mmHg,(19.78±1.68)mmHg,P<0.0001或P<0.001]。3.与对照组、PE组、SU组相比,PE+SU组MT%明显升高[(49.04±10.37)%vs(27.12±5.13)%,(33.52±6.16)%,(37.17±6.90)%,P值均<0.0001],PE+SU组肺小动脉有明显形态学改变,以远端细小动脉改变最为突出,主要表现为血管中膜平滑肌层增厚,平滑肌细胞增生,管腔有缩小。4.与对照组、PE组、SU组相比,PE+SU组RVHI明显增加[(0.42±0.06)vs(0.26±0.03),(0.29±0.03),(0.34±0.02),P<0.0001 或 P<0.001 或 P<0.01]。5.各组间PKM1、PKM2的表达水平均无统计学差异(P>0.05)。结论本研究采用Sugen5416损伤内皮联合多次自体血栓栓塞肺动脉联合构建了轻中度CTEPH大鼠模型,虽存在一定局限性,但这个新模型也提示了 CTEPH发生发展与内皮损伤和血栓栓塞多重因素的潜在联系。为构建成熟稳定的CTEPH动物模型提供思路和为深入理解CTEPH病理生理机制提供思路。