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目的:本研究拟在牛牙本质块上建立粪肠球菌生物膜感染的体外模型,应用扫描电镜观察不同阶段粪肠球菌在牛牙本质小管内的生长情况,灭菌处理后通过激光扫描共聚焦显微镜和扫描电镜对生物膜细菌进行定量和定性分析,以评估亚甲基蓝介导的光动力疗法(MB-PDT)对粪肠球菌生物膜的杀菌作用,为牙髓根尖周病的预防和治疗提供新思路。方法:将粪肠球菌接种于无菌牛牙本质块上,37℃分别孵育1w和3w,以建立不同时间点形成的粪肠球菌生物膜模型,使用扫描电镜观察样本髓腔表面以确定生物膜形成,选取1w样本作为年轻生物膜模型,3w样本作为成熟生物膜模型;对1w和3w的样本分别应用5%NaOCl(A组)、MB-PDT(B组)、无菌生理盐水(C组)进行灭菌处理,每组又分为三个亚组,分别处理3min、12min和30min,随后,采用细菌活性荧光染料对处理后的样本进行染色,立即置于激光扫描共聚焦显微镜下观察,利用Imaris软件对CLSM图像进行三维重建,并计算不同生物膜中死亡细菌的比例,从而评估MB-PDT的杀菌效果;选取1w生物膜样本,利用MB-PDT处理12min,在扫描电镜下观察处理前后生物膜形态结构的变化,进一步明确MB-PDT的杀菌作用;MB-PDT分别作用于无菌牛牙本质块12min和30min,通过扫描电镜观察髓腔内壁牙体组织显微结构变化,分析MB-PDT对牙本质表面形貌的影响。结果:1、成功建立不同时间点的粪肠球菌生物膜体外模型,在扫描电镜下可观察到牛牙本质块上有粪肠球菌定植;2、经过三维重建后的细菌生物膜图片显示,MB-PDT可有效的杀灭绝大多数生物膜细菌,但灭菌效果显著低于5%NaOCl(P<0.05);随着处理时间的延长,死菌比例增加(P<0.05);相同的处理方法和时间,1w年轻生物膜的死菌比例显著高于3w成熟生物膜(P<0.05);3、MB-PDT处理后,扫描电镜下可见粪肠球菌生物膜结构破坏,细菌数量显著减少,残留细菌形态异常;4、MB-PDT在一定作用时间内不会导致牙体硬组织显微结构发生变化。结论:MB-PDT可以有效杀灭粪肠球菌,而不引起牙体硬组织显微结构的变化,但单独使用灭菌效果不如5%NaOCl。在牙髓根尖周病治疗过程中,MB-PDT可以作为传统根管治疗的辅助方法,以提高杀菌率。激光扫描共聚焦显微镜能对一定厚度的标本进行断层扫描,是观察牙本质小管内细菌生活状态的一种有效方法。