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背景:阿尔茨海默病(AD)是最为常见的神经退行性疾病。细胞内神经原纤维缠结(NFT)是AD的标志性病理改变之一,其主要成分是过度磷酸化的微管相关蛋白Tau。钙稳态失衡被广泛的认为是AD发病的起始因素之一,核钙信号作为影响基因转录和突触活性的重要因素,是否参与AD的发病机制,磷酸化Tau蛋白能否激活核钙信号以及核钙信号能否影响Tau蛋白的磷酸化,仍不清楚。本研究在人胚肾293细胞(HEK293细胞)过表达人类的全长Tau蛋白(h Tau),观察不同位点磷酸化h Tau蛋白的细胞内分布及细胞核磷酸化Tau蛋白与核钙信号的相互作用。目的:探讨不同位点磷酸化h Tau蛋白的细胞内分布及细胞核磷酸化的Tau蛋白与核钙信号的相互影响。方法:(1)HEK293细胞瞬时转染红色荧光标记的h Tau(Ds Red2-N1-human Tau)蛋白,24小时后进行Western blotting检测Tau蛋白在多个AD相关位点的磷酸化水平及其在细胞浆和细胞核内分布差异;同时用绿色钙离子荧光指示剂Fluo-3AM孵育,在激光共聚焦显微镜下检测细胞浆和细胞核中钙离子浓度。免疫荧光定位检测苏氨酸-205位点磷酸化的Tau蛋白(PT205)和丝氨酸-214位点磷酸化的Tau蛋白(PS214)分别与Hoechest在胞核共定位。(2)在HEK293细胞瞬时转染苏氨酸-205及丝氨酸-214位点突变为丙氨酸或谷氨酸的Tau蛋白(T205A,T205E,S214A,S214E)分别模拟这两个位点的非磷酸化和磷酸化状态,24小时后用绿色钙离子荧光指示剂Fluo-3AM孵育,在激光共聚焦显微镜下检测细胞核内钙离子浓度,同时用Western blotting检测胞核内钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅳ(CAMKⅣ)和c AMP反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化水平。(3)HEK293细胞瞬时转染红色荧光标记的h Tau(Ds Red2-N1-human Tau)蛋白,24小时后,用磷酸酯酶抑制剂冈田酸(OA)处理12小时,诱导Tau蛋白过度磷酸化,再用绿色钙离子荧光指示剂Fluo-3AM孵育,在激光共聚焦显微镜下检测细胞核内钙离子浓度变化,同时用Western blotting检测细胞核钙信号分子,包括CAMKⅣ在苏氨酸-196(Thr196)位点磷酸化水平,CREB在丝氨酸-129(Ser129)及丝氨酸-133(Ser133)位点的磷酸化水平以及GSK-3β的Ser9抑制性位点磷酸化水平。(4)在稳定转染Tau蛋白的HEK293细胞(293Tau cells)转染钙调蛋白结合肽段(CAMBP4)抑制核钙信号,24小时后,再给予OA处理12小时,用Western blotting检测细胞核Tau蛋白磷酸化水平,CAMKⅣ在苏氨酸-196(Thr196)位点磷酸化水平以及GSK-3β的Ser9抑制性位点磷酸化水平。结果:(1)在HEK293细胞表达外源性人类全长Tau蛋白后,胞浆及胞核提取液中Tau蛋白的多个AD相关磷酸化位点磷酸化,包括Thr205,Ser214,Thr231,Ser396,Ser404,其中,Thr205及Ser214位点磷酸化的Tau蛋白仅在胞核提取液中显色,而在胞浆中呈阴性反应。并且,免疫荧光共定位显示苏氨酸-205位点磷酸化的Tau蛋白(PT205)和丝氨酸-214位点磷酸化的Tau蛋白(PS214)分别与Hoechest在胞核共定位;同时,表达Tau蛋白导致胞浆和胞核中钙离子浓度增高。(2)与Tau蛋白Thr205非磷酸化突变体(T205A)相比,表达Tau蛋白Thr205模拟磷酸化突变体(T205E)使细胞核钙离子浓度升高,使核CAMKⅣ在Thr196位点磷酸化水平增强,CREB在Ser129及Ser133位点磷酸化水平增强,激活核Ca2+/CAMKⅣ/CREB信号通路。(3)与Tau蛋白Ser214非磷酸化突变体(S214A)相比,表达Tau蛋白Ser214模拟磷酸化突变体(S214E)对细胞核钙离子水平无显著影响,且仅增强CREB的丝氨酸-129位点磷酸化水平,而CAMKⅣ苏氨酸-196位点以及CREB丝氨酸-133位点磷酸化水平无改变。(4)OA处理12小时后,表达外源性人类全长Tau蛋白的HEK293细胞核多个AD相关磷酸化位点的磷酸化水平进一步增强,胞核的钙离子水平显著增高,同时胞核CAMKⅣ的苏氨酸-196位点以及CREB的丝氨酸-129及丝氨酸-133位点磷酸化水平增高,提示胞核Tau蛋白的过度磷酸化激活核Ca2+/CAMKⅣ/CREB信号通路。(5)稳定转染Tau蛋白的HEK293细胞(293Tau cells)瞬时转染钙调蛋白结合蛋白(CAMBP4)以阻止Ca2+/Calmodulin复合物的形成,24小时后再给予OA处理12小时,发现胞核多个AD相关Tau蛋白磷酸化位点的磷酸化水平显著降低,提示细胞核钙信号的激活对核Tau蛋白磷酸化起重要作用。(6)CAMBP4使细胞核GSK-3β丝氨酸-9位点磷酸化水平降低(丝氨酸-9位点是抑制性磷酸化位点),增强GSK-3β活性。OA处理过表达Tau蛋白的HEK293细胞,引起细胞核GSK-3β丝氨酸-9位点磷酸化水平增高,抑制GSK-3β活性。提示GSK-3β活性受核钙信号调控,但不参与核钙信号激活诱导的核Tau蛋白过度磷酸化。结论:Tau蛋白在苏氨酸-205及丝氨酸-214位点的磷酸化特异性的定位于细胞核。核Tau蛋白某些位点的磷酸化如苏氨酸-205位点的磷酸化,能够触发核Ca2+/Ca MKⅣ/CREB信号,后者反过来又加剧核Tau蛋白的磷酸化。GSK-3β活性受核钙信号调控,但不参与核钙信号激活诱导的核Tau蛋白过度磷酸化。