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原发性肺癌目前是全球发病率与死亡率较高的恶性肿瘤之一,近年来我国肺癌发病率与死亡率呈逐年上升趋势,现已成为我国城市人口癌症死亡的首要原因。原发性肺癌患者约70%需接受放射治疗,但由于癌组织中乏氧细胞的大量存在、抗放射损伤等,在一定程度上限制了放疗的应用,放射增敏剂不仅使肿瘤组织对放射线的敏感性大大增加,局部控制程度明显提高,同时还可减少肿瘤局部复发和转移,因此对肺癌放射增敏剂的研究具有重要深远的意义。RNAi是一种与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象,具有高效、高特异性及对靶基因高选择性等特点,能高效抑制特定基因的表达,效果接近于基因敲除技术,目前已广泛应用于各种肿瘤的发病机制及肿瘤基因治疗研究中。从前期的结果中我们认为扶正增效方具备成为放射增敏剂的基本条件,其放射增敏作用的主要蛋白是S100A9、CyPA,但这只是定性的初步研究、而不是定量的研究,而且具体哪种基因发挥主要作用尚不清楚,本课题为国家自然科学基金(NO.81072925)资助课题,用q-PCR、Western-blot等技术和RNAi等方法验证和从量上分析了中药对这两个基因的放射增敏作用。目的：具体S100A9、亲环素A在扶正增效方对肺癌放射增敏中的作用和地位。用RNAi技术验证放射增敏相关靶点—S100A9、CyPA,此将为确定放射增敏相关预测因子和放射增敏药物的研发具有重要意义。方法：建立裸鼠人肺腺癌移植瘤模型,分4组,空白组、中药组、放射组、中药+放射组,当瘤积达1cm3左右时,一次给予放射组、中药+放射组瘤体10Gy剂量照射。观察抑瘤率；Western blot检测S100A9、CyPA蛋白表达；用实时荧光定量RT-PCR法检测S100A9、CyPA mRNA表达；慢病毒介导目的基因敲降技术沉默肺腺癌S100A9、CyPA, Western blot筛选出S100A9和CyPA RNAi有效的干扰靶点序列。干扰后分为空白组、阴性对照组、RNAi S100A9组、RNAiCyPA组,照射后通过集落形成实验计算克隆生成率和存活分数,利用单击多靶模型评价RNAi技术沉默肺腺癌S100A9、CyPA后细胞辐射敏感性,流式细胞仪测定细胞周期。结果：通过实验发现扶正增效方有一定抑瘤作用,与对照组、中药组、放射组比较,中药加放射组抑瘤率显著增高。Western blot结果显示：放射后6h,与对照组比较,S100A9、CyPA蛋白各组表达有所下降,但无差异。放射后12h,与对照组比较,中药+放射组蛋白表达降低,有显著性差异(P<0.05)。放射后24h,S100A9蛋白表达,放射组与对照组比较降低,有显著性差异(P<0.05)。中药+放射组表达相对各组均有显著性差异(P<0.05)。CyPA蛋白表达,放射组与对照组、中药组比较均降低,有显著性差异(P<0.05)。中药+放射组表达相对各组均降低,且有显著性差异(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示：放射后6h,与对照组比较,各组S100A9、CyPA mRNA各组表达有所下降,但无差异。放射后12h,与对照组比较,放射组S100A9mRNA表达下降,有差异(P<0.05)。中药+放射组与对照组、中药组比较均降低,有显著性差异(P<0.05)。放射后12h,与对照组比较,放射组、中药+放射组CyPA mRNA表达下降,有显著性差异(P<0.05)。放射后24h, S100A9、CyPA mRNA表达,放射组与对照组、中药组比较均降低,有显著性差异(P<0.05)。中药+放射组表达相对各组均有下降,且有显著性差异(P<0.05)。进一步构建S100A9RNAi和CyPA RNAi’慢病毒表达质粒并包装出慢病毒,通过Westernblot筛选出S100A9和CyPA RNAi有效的干扰靶点序列,制备了S100A9和CyPA shRNA/PAa稳转细胞。通过集落形成实验计算克隆生成率和存活分数,利用单击多靶模型得出RNAi (S100A9、CyPA)后降低了肿瘤细胞SF2Gy值、Do值、Dq值,增加了辐射效应,增强射线对肿瘤细胞的杀伤作用。流式细胞仪检测发现,RNAi沉默S100A9和CyPA后,未照射时,各组G0/G1、S的细胞有差异,但无统计学意义,G2/M期细胞,S100A9组相对空白组增加,有统计学意义(P<0.05),CyPA组相对空白组和对照组增加,有统计学意义(P<0.05)。2Gy照射后,S100A9和CyPA组相对空白组和对照组,Go/G1期细胞明显减少(P<0.05),G2/M期细胞显著增多(P<0.05),S100A9组S期细胞降低,但无差异,CyPA组S期细胞显著降低(P<0.05)。结论：本实验证明了扶正增效方对肺腺癌具有一定的抑瘤作用和较强的放射增敏作用。通过Western blot和q-PCR检测S100A9、CyPA表达,发现扶正增效方通过下调S100A9和CyPA表达对肺腺癌起到放射增敏作用。尤其在放射后24小时表达显著降低,差异有统计学意义。进一步采用慢病毒介导的S100A9和CyPA基因沉默,Westerblot筛选出有效的干扰靶点序列,制备了S100A9和CyPA shRNA/PAa稳转细胞。在体外实验发现慢病毒介导的S100A9和CyPA shRNA能使细胞阻滞在G2/M期的比例增高,细胞辐射敏感性增高。