目的：通过体外实验研究,观察四逆散、六味地黄丸对神经干细胞(neural stem cells, NSCs)增殖及向神经元分化的影响,并探讨其作用机制。旨在从细胞水平探讨肝主疏泄、肾主藏精及肝肾藏泄互用关系的实质,为疏肝法或补肾法结合干细胞技术在临床上治疗疑难疾病提供理论与实验依据。方法：一、中医基础理论研究通过文献研究,总结和分析中医先天之精与肝主疏泄、肾主藏精的关系,先天之精与干细胞内在联系及疏肝方药、补肾方药对干细胞的影响。在此基础上,探讨肝主疏泄、肾主藏精与干细胞的关系。二、实验研究(一)NSCs培养与鉴定本研究实验动物为新生24h内、清洁级SD大鼠,雌雄不限,10只,NSCs取材部分为海马脑区。细胞接种密度1×105个细胞/ml。细胞培养体系：DMEM/F12培养基,添加终浓度为20ng/ml的bFGF, EGF、2%B27、1%双抗及1%L-谷氨酰胺。隔天30%换液1次。1.通过倒置显微镜,在形态学上观察细胞增殖及形成神经球的能力。2.免疫细胞荧光化学技术检测NSCs的巢蛋白(neuroepithelial stem cell protein, Nestin)、胚胎干细胞关键蛋白(Sry related HMG box-2, SOX2)的表达。3.MTT法检测NSCs增殖能力。4.通过倒置显微镜,在形态学上观察细胞分化的情况,并采用免疫细胞荧光化学技术鉴定所分化的细胞,神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体(neuron-specific enolase,NSE)鉴定神经元,胶质纤维酸性蛋白单克隆抗体(Glial fibrillary acidic protein, GFAP)鉴定星形胶质细胞,髓鞘碱性蛋白单克隆抗体(Myelin basic protein,MBP)鉴定少突胶质细胞。(二)四逆散、六味地黄丸诱导NSCs增殖及c-my、CyclinDl mRNA表达的研究1.分组处理选取第3代NSCs进行分组造模。(1)空白对照组：DMEM/F12(1:1)培养基。(2)四逆散低剂量组：DMEM/F12(1:1)培养基加入四逆散低浓度煎剂(终浓度含生药量0.133g／L)。(3)四逆散高剂量组：DMEM/F12(1:1)培养基加入四逆散高浓度煎剂(终浓度含生药量0.267g／L)。(4)六味地黄丸低剂量组：DMEM/F12(1:1)培养基加入六味地黄丸低浓度煎剂(终浓度含生药量0.208g／L)。(5)六味地黄丸高剂量组：DMEM/F12(1:1)培养基加入六味地黄丸高浓度煎剂(终浓度含生药量0.416g／L)。各组细胞隔天30%换液1次,培养4d。2.检测指标及方法采用Brdu免疫细胞荧光化学技术标记法,每天检测细胞增殖情况。采用实时荧光定量PCR法(real-time fluorescent quantitative Polymerase chain reaetion, Real time-PCR)检测各组细胞c-myc及CyclinDl mRNA表达。(三)四逆散、六味地黄丸诱导NSCs向神经元分化及Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白、基因表达的研究1.分组处理选取第3代NSCs进行分组造模。(1)空白对照组：DMEM/F12(1:1)培养基,添加10%胎牛血清。(2)四逆散低剂量组：DDMEM/F12(1:1)培养基加入10%胎牛血清和四逆散低浓度煎剂(终浓度含生药量0.133g／L)。(3)四逆散高剂量组：采用DMEM/F12(1:1)培养基加入10%胎牛血清和四逆散高浓度煎剂(终浓度含生药量0.267g／L)。(4)六味地黄丸低剂量组：采用DMEM/F12(1:1)培养基加入10%胎牛血清和六味地黄丸低浓度煎剂(终浓度含生药量0.208g／L)。(5)六味地黄丸高剂量组：采用DMEM/F12(1:1)培养基加入10%胎牛血清和六味地黄丸高浓度煎剂(终浓度含生药量0.416g／L)。隔天换液1次,培养7d。2.指标检测及方法采用免疫细胞荧光化学技术检测NSE阳性细胞计数法计算各组细胞的神经元分化率。采用蛋白免疫印迹法(Western-blotting, WB)检测各组细胞的Wnt1、Wnt3a、 β-catenin蛋白相对表达量。采用Real time-PCR法检测各组细胞的Wnt1、Wnt3a、 β-catenin基因相对表达量。结果：一、理论研究先天之精生理功能的正常发挥均依赖肝主疏泄及肾主藏精的调控作用；中医先天之精与干细胞在来源、功能和分布等方面均存在相似之处；疏肝方药、补肾方药对干细胞均有一定的干预效应。二、实验研究(一)NSCs培养与鉴定1.细胞增殖及成球形态学观察结果原代NSCs接种培养24h后,细胞胞体呈圆形,多数细胞透光性较好,生长状态良好。少量细胞形态呈梭形,透光性差,生长状态不良,甚至下沉死亡,这些细胞可能不是NSCs。其余细胞单个悬浮生长,少数细胞几个细胞抱团生长。细胞总体数量比接种时明显增多。培养2-3d后,单个悬浮生长细胞逐渐减少,多数细胞聚集抱团生长,形成许多悬浮的神经球,特别是3d后,神经球数量呈几倍增长的态势,神经球体积不断增大,细胞不断增多。培养4d后,神经球体积不断增大,多数球体的直径在100μm左右,神经球直径在100μm以内,球体透光性较好,显示出良好的生长状态。5-7d后,神经球体积不断增大,多数神经球球体直径超过150μm。神经求直径超过100μm,中部的细胞营养缺乏,生长状态不是太好,球体中央光线稍暗,球直径越大,透光性就越差。2. Nestin及SOX2表达结果Nestin、SOX2均表达阳性。3.MTT检测细胞增殖结果细胞接种后1-4d内,细胞数量不断增加,MTT值从接种之初的0.13上升至最高值0.31。接种3d后MTT值为0.28,是接种之初MTT值0.13的2倍多,因此,细胞接种3d后,细胞增殖达到接种时的2倍多。接种4d后,MTT值为0.31,细胞增殖达到峰值。5d后,MTT值为0.29,细胞数量较前下降,随后6、7d, MTT值逐渐降低,特别是7d时MTT值0.22,几乎降至接种后1d的水平。本实验结果提示细胞接种培养4d后,细胞增殖数量最高,可以达到传代要求。4. NSCs分化结果(1)细胞分化形态学观察结果神经球接种到多聚鸟氨酸包被细胞爬片,经血清诱导培养2h后,倒置显微镜下可见,神经球紧贴细胞爬片生长,神经球形状变扁,球体向四周扩展,体积变大,球体四周细胞逐渐往外迁移。48h后可见,在神经球由球形变成不规则形状,往外迁移的细胞逐渐增多,并分化成其它形状不一的细胞。3d后,可见到神经球外周各种形态的细胞不断增多,纵横交错。7d后,NSCs神经球基本消失,完全分化成各种不同形态细胞。(2)NSE、 GFAP、MBP表达检测结果NSE、 GFAP、 MBP表达阳性。NSCs所分化的细胞包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。(二)四逆散、六味地黄丸诱导NSCs增殖及c-myc、 CyclinDl mRNA表达的研究结果1.细胞增殖结果：各组细胞在1-4d内均处于增殖状态,其中六味地黄丸高、低剂量组增殖最明显,均比其它各组高(P<0.01)；而六味地黄丸低、高剂量组之间比较没有差异(P>0.05)；空白对照组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组之间比较没有差异(P>0.05)。2.Real time-PCR法结果(1)c-myc mRNA在六味地黄丸低、高剂量组表达最高,与空白对照组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组比较有显著差异(P<0.01)；而六味地黄丸低、高剂量组之间比较没有差异(P>0.05)；空白对照组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组之间比较没有差异(P>0.05)。(2)CyclinDl mRNA在六味地黄丸低、高剂量组表达最高,与空白对照组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组之间比较有显著差异(P<0.01),而六味地黄丸低、高剂量组之间比较没有差异(P>0.05),空白对照组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组之间比较没有差异(P>0.05)。(三)四逆散、六味地黄丸诱导NSCs向神经元分化及Wnt1、 Wnt3a、β-catenin蛋白、基因表达的研究结果1.各组细胞分化形态学的观察结果神经球接种到多聚鸟氨酸包被细胞爬片,经血清诱导培养2h后,倒置显微镜下可见,神经球紧贴细胞爬片生长,神经球形状变扁,球体向四周扩展,体积变大,球体四周细胞逐渐往外迁移。随着时间往后推移,神经球由球形变成不规则形状,往外迁移的细胞逐渐增多,在神经球四周,不断出现一些形态不规则的细胞,纵横交错。7d后,NSCs神经球基本消失,完全分化成各种不同形态细胞。2.神经元分化率(1)六味地黄丸低剂量组12.15±2.32%。(2)六味地黄丸高剂量组12.58±1.70%。(3)四逆散低剂量组12.28±1.01%。(4)四逆散高剂量组11.84±1.01%。(5)空白对照组6.16±1.42%。空白对照组神经元分化率最低,与六味地黄丸低、高剂量组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.01)。而六味地黄丸低、高剂量组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.WB法检测结果(1)Wntl蛋白表达Wntl在空白对照组表达最低,与六味地黄丸低、高剂量组及四逆散低、高剂量组比较有显著差异(P<0.01),六味地黄丸低、高剂量组之间比较没有差异(P>0.05),四逆散低、高剂量组之间比较没有差异(P>0.05),六味地黄丸低剂量组与四逆散低、高剂量组之间比较没有差异(P>0.05),但六味地黄丸高剂量组表达均高于四逆散低、高剂量组(P<0.05)。(2)Wnt3a蛋白表达Wnt3a在空白对照组中表达最低,与六味地黄丸低、高剂量组及四逆散低、高剂量组的比较有显著差异(P<0.01),而六味地黄丸低、高剂量组及四逆散低、高剂量组之间比较无明显的差异(P>0.05)。(3)β-catenin蛋白表达β-catenin在空白对照组的表达最低,与六味地黄丸低、高剂量组及四逆散低、高剂量组比较有显著差异(P<0.01),而六味地黄丸低、高剂量组之间比较没有差异(P>0.05),六味地黄丸低剂量组表达均比四逆散低、高剂量组高(P<0.05,P<0.01),六味地黄丸高剂量组、四逆散低剂量组均比四逆散高剂量组高(P<0.01,P<0.05),但六味地黄丸高剂量组和四逆散低剂量组之间比较无差异(P>0.05)。4. Real time-PCR法检测结果(1)Wntl基因表达Wntl在空白对照组表达最低,与六味地黄丸低剂量组、六味地黄丸高剂量组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组比较有显著差异(P<0.01),而六味地黄丸低剂量组、六味地黄丸高剂量组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组之间比较无明显差异(P>0.05)。(2)Wnt3a基因表达Wnt3a在空白对照组表达最低,与六味地黄丸低剂量组、六味地黄丸高剂量组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组比较有显著差异(P<0.01),而六味地黄丸低剂量组、六味地黄丸高剂量组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组之间比较无明显差异(P>0.05)。(3) β-catenin基因表达β-catenin在空白对照组表达最低,与六味地黄丸低剂量组、六味地黄丸高剂量组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组比较有显著差异(P<0.01),而六味地黄丸低剂量组、六味地黄丸高剂量组、四逆散低剂量组及四逆散高剂量组之间比较无明显差异(P>0.05)。结论：一、理论研究结论中医先天之精与干细胞在来源、功能和分布等方面均存在相似之处,肝主疏泄、肾主藏精功能,不但对先天之精发挥调节作用,对干细胞也有一定的调节作用。肝肾藏泄互用的关系不仅体现为对人体正常生殖功能的调控作用,而应更广泛体现在维持人体正常的生长发育及机体疾病或损伤后的修复过程。二、实验研究结论(一)本实验所培养的细胞为具有自我增殖及多向分化潜能的NSCs;采用单纯机械吹打方法分离NSCs,可以使细胞避免胰蛋白酶损伤及血清的干扰,可获得具有很好活力及增殖能力的细胞；细胞接种培养4d后是细胞传代的最佳时间,本方法培养NSCs具有可行性、可重复性,并且可更节省时间和资源。(二)六味地黄丸对体外培养NSCs增殖有明显促进的效应,可明显上调NSCs c-myc. CyclinDl mRNA表达,与剂量大小没有明显关系。但四逆散对体外培养NSCs增殖没有明显促进的效应,没有明显上调NSCs的c-myc.CyclinDl mRNA表达。(三)四逆散与六味地黄丸均能促进体外培养NSCs向神经元分化,可上调NSCs的Wnt1、Wnt3a及β-catenin蛋白、基因表达,其促进NSCs向神经元分化作用机制可能与上调Wntl.Wnt3a及β-catenin表达、激活wnt/β-catenin信号转导通路有关。本研究结论：在NSCs层面上,肝主疏泄功能主要表现为通过激活Wnt/β-catenin信号转导通路,促进体外NSCs向神经元分化,肾主藏精功能主要表现为促进体外NSCs增殖及激活Wnt/β-catenin信号转导通路促进NSCs向神经元分化,而肝肾“藏泄互用”的关系实质内涵可体现为对NSCs增殖与分化的调控作用,其中“藏”内涵主要体现为对NSCs增殖与分化的调控,“泄”内涵主要体现为对NSCs分化的调控。