大血管病变,如冠心病,中风是导致糖尿病患者死亡的最主要原因。糖尿病大血管病变的病理基础是动脉粥样硬化斑块的破裂,主要表现为内皮细胞凋亡,纤维帽变薄,坏死脂质核心破裂,脱落,形成不稳定的动脉粥样硬化斑块。目前针对糖尿病大血管病变的疗效并不能令人满意,如：降脂和抗血小板的药物不能稳定动脉粥样斑块,而球囊扩张可能导致再狭窄。因此,探索糖尿病大血管病变的发病机制,并寻找新的稳定糖尿病动脉粥样硬化斑块的方法,是治疗糖尿病心脑血管疾病等糖尿病大血管病变的重要手段。内皮细胞在维持动脉粥样硬化斑块稳定性上发挥着重要的作用。高糖、高血脂和高血压可引起内皮功能障碍进而破坏内皮细胞的完整性。主要表现为血管壁内皮损伤,通透性增高,胆固醇和氧化低密度脂蛋白浸润到血管内膜下,并大量堆积形成动脉粥样硬化斑块。随着动脉粥样斑块的发展,内皮细胞凋亡,纤维帽变薄,大的坏死脂质核心脱落形成血栓。内皮祖细胞(EPCs)是一类骨髓来源的内皮前体细胞,当内皮功能发生障碍时,内皮祖细胞能够从骨髓动员到损伤部位,分化为成熟内皮细胞,进而修复损伤的内皮。但是,正常情况下,内皮祖细胞向内皮损伤部位动员非常有限。因此,提高内皮祖细胞的动员可能是一种新的方法来稳定动脉粥样硬化斑块。趋化因子受体5(CCR5)作为p趋化因子受体家族成员之一,是一类G蛋白7次偶联跨膜受体。CCR5主要表达在T细胞和单核细胞/巨噬细胞上。在动脉粥样硬化过程中,敲除CCR5基因的表达能够减少单核/巨噬细胞向动脉粥样斑块的集聚。CCR5的同源配体趋化因子配体5(CCL5),作为CC-趋化因子家族的成员,主要由活化的T细胞和血小板储存和释放。在动脉粥样硬化的过程中,CCL5表达升高主要经由活化的血小板释放。增加的CCL5附着在受损内皮细胞的表面,通过与它们的受体CCR5结合进而介导单核／巨噬细胞向血管损伤的部位集聚。迄今为止,CCR5在斑块稳定性中作用尚不清楚。最新研究显示CCR5能够刺激骨髓来源内皮祖细胞的动员,促进肾小球微血管新生,抑制CCR5的表达能够降低内皮祖细胞向皮肤损伤部位的聚集。因此,我们推测增加内皮祖细胞上CCR5的表达,能够增加内皮祖细胞向动脉内皮损伤部位的归巢和动员,进而促进动脉粥样硬化斑块的稳定。第一部分趋化因子CCR5促进内皮祖细胞向动脉内皮损伤部位迁移的研究目的探讨趋化因子CCR5在内皮祖细胞向内皮损伤部位迁移的趋化作用。方法1动物模型10-12周龄的2型糖尿病ApoE-/-C57BL/6J雄性脾切除小鼠用于实验。选取8-10周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠用于内皮祖细胞提取。2脾切除手术8-10周龄的ApoE-/-C57BL/6J雄性小鼠给予0.8%戊巴比妥钠(10 mg/kg)麻醉,沿小鼠左侧腹部行10-15mm切口,脾脏周围的动静脉被结扎后移除脾脏,小鼠术后适应性喂养7-14天,再行后续实验。3小鼠2型糖尿病模型的建立将脾切除的ApoE-/-C57BL/6J小鼠,按小鼠每公斤体重给予35mg链脲佐菌素(STZ,35mg/kg),腹腔注射STZ溶液,间隔24h后再次腹腔注射给药,连续注射3天。对照组,ApoE-/-C57BL/6J小鼠腹腔给予等量的柠檬酸钠缓冲液。造模后每天检测小鼠体重变化,每周测量小鼠血糖,当血糖值在300 mg/dl及其以上者,作为2型糖尿病模型成功标准。4小鼠骨髓来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定选取8-10周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠颈椎脱臼处死,无菌条件下,分离提取小鼠胫骨,股骨和髂骨中的单个核细胞,梯度离心后接种在纤维连结蛋白包被的六孔板中,放置于37℃,5% CO2孵箱中培养,三天后细胞第一次给予完全换液,弃掉未贴壁的细胞。第六天时,细胞给予半量换液,继续培养至第七天即用于鉴定。细胞分别给予Dil-acLDL, BS-1 lectin和DAPI染色后,荧光显微镜观察阳性染色细胞,三色荧光阳性染色的细胞即为内皮祖细胞。5慢病毒转染内皮祖细胞将过表达CCR5质粒的慢病毒载体按MOI=40转染入内皮祖细胞中,携带有空白质粒的慢病毒载体转染入内皮祖细胞中作为阴性对照,转染24小时后给予完全换液,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,继续培养48-72小时。在内皮祖细胞移植之前,培养的细胞给予CM-DiI (4 mg/ml)活细胞染料孵育15分钟,双重标记的EPCs被收集,用于下一步试验。6试验设计40只脾切除的2型糖尿病ApoE-/- C57BL/6J雄性小鼠给予高胆固醇饮食喂养24周,然后根据小鼠耳标号,应用随机数字表,将老鼠随机分为三组：Control组：尾静脉给予200μl无菌的PBS, Lenti-EGFP组：尾静脉给予200μl1×106携带有空载质粒的内皮祖细胞,Lenti-CCR5组：尾静脉给予200μl×106携带有过表达CCR5质粒的内皮祖细胞。内皮祖细胞输注后,所有老鼠改为普通饮食,继续喂养6周后处死。7免疫荧光检测CD31免疫荧光染色检测小鼠主动脉根处内皮细胞表达分布。8内皮祖细胞功能学检测Transwell迁移小室和Edu增殖能力实验分别检测内皮祖细胞的迁移和增殖能力。9统计学分析所有统计学数据均使用SPSS 18.0软件分析。计量资料以均数土标准差表示,计数资料以数值和百分比表示。统计分析采用t检验、Oneway ANOVA或LSD post-hoc分析。当P<0.05被认为具有显著性统计学差异。结果1成功构建重组过表达慢病毒载体经重组慢病毒载体测序实验验证,CCR5慢病毒表达载体构建和包装成功,空白载体的慢病毒滴度为3×1010 ifu/ml, CC过表达载体的慢病毒滴度为2.8×1010ifu/ml。2成功分离提取和鉴定EPCsEPCs培养至第7天,细胞分别给予DiI-acLDL(红色),BS-1 lectin(绿色)和DAPI (蓝色)染色后,结果发现90%以上细胞均能成功摄取DiI-acLDL和BS-1 lectin,表现为三色荧光(红色+绿色+蓝色)阳性。3慢病毒转染EPGs后感染效率免疫荧光评价EPCs转染慢病毒后的感染效率,结果发现80%及以上的细胞为绿色荧光蛋白表达阳性细胞,提示慢病毒转染成功。4过表达CCR5增加EPCs向内皮损伤部位的归巢,动员取小鼠主动脉根的冰冻切片,给予DAPI染色,结果发现：在2型糖尿病小鼠主动脉根的内皮和内皮下层能明显观察到EPCs,提示EPCs能成功植入到血管壁内皮层。此外,过表达CCR5内皮祖细胞(Lenti-CCR5)组,内皮祖细胞在内皮损伤部位聚集的数量明显高于单纯内皮祖细胞(Lenti-EPCs)组,提示CCR5过表达后能增加EPCs向内皮损伤部位迁移的能力。5过表达CCR5增加EPGs迁移能力为了检测CCR5对EPCs功能学影响,我们分别检测了Lenti-EGFP和Lenti-CCR5两组细胞的增殖和迁移能力的变化。结果发现,在趋化因子CCL5存在的情况下,Lenti-CCR5组能明显增加EPCs迁移能力(P<0.01),但是两组细胞的增殖能力并未见明显差异(P=0.98)。结论1.过表达CCR5能够增加内皮祖细胞向动脉内皮损伤部位的归巢、动员作用；2.过表达CCR5能提高内皮祖细胞迁移能力,但是对其增殖能力没有影响。小鼠主动脉根的内皮和内皮下层能明显观察到EPCs,提示EPCs能成功植入到血管壁内皮层。此外,过表达CCR5内皮祖细胞(Lenti-CCR5)组,内皮祖细胞在内皮损伤部位聚集的数量明显高于单纯内皮祖细胞(Lenti-EPCs)组,提示CCR5过表达后能增加EPCs向内皮损伤部位迁移的能力。5过表达CCR5增加EPGs迁移能力为了检测CCR5对EPCs功能学影响,我们分别检测了Lenti-EGFP和Lenti-CCR5两组细胞的增殖和迁移能力的变化。结果发现,在趋化因子CCL5存在的情况下,Lenti-CCR5组能明显增加EPCs迁移能力(P<0.01),但是两组细胞的增殖能力并未见明显差异(P=0.98)。结论1.过表达CCR5能够增加内皮祖细胞向动脉内皮损伤部位的归巢、动员作用；2.过表达CCR5能提高内皮祖细胞迁移能力,但是对其增殖能力没有影响。第二部分过表达内皮祖细胞上CCR5改善动脉粥样硬化斑块稳定性目的探讨过表达内皮祖细胞上CCR5对动脉粥样斑块稳定性研究。方法1动物模型10-12周龄的ApoE-/-C57BL/6J雄性脾切除小鼠用于实验。选取8-10周龄的野生型C57BL/6J雄性小鼠用于内皮祖细胞的提取。2脾切除手术8-10周龄的ApoE-/- C57BL/6J雄性小鼠给予0.8%戊巴比妥钠(10 mg/kg)麻醉,沿小鼠左侧腹部行10-15mm切口,脾脏周围的动静脉被结扎后移除脾脏,小鼠术后适应性喂养7-14天,再行后续实验。3小鼠骨髓来源的EPCs分离、培养及鉴定选取8-10周龄的野生型C57BL/6J雄性小鼠颈椎脱臼处死,无菌条件下,分离提取小鼠胫骨,股骨和髂骨中的单个核细胞,梯度离心后接种在纤维连结蛋白包被的六孔板中,放置于37℃,5% CO2孵箱中培养,三天后细胞第一次给予完全换液,弃掉未贴壁的细胞。第六天时,细胞给予半量换液,继续培养至第七天即用于鉴定。细胞分别给予DiI-acLDL, BS-1 lectin和DAPI染色后,荧光显微镜观察阳性染色细胞,三色荧光(红色+绿色+蓝色)阳性染色的细胞即为内皮祖细胞。4慢病毒转染内皮祖细胞将过表达CCR5质粒的慢病毒载体按MOI=40转染入内皮祖细胞中,携带有空白质粒的慢病毒载体转染入内皮祖细胞中作为阴性对照,转染24小时后给予完全换液,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,继续培养48-72小时。在内皮祖细胞移植之前,培养的细胞给予CM-DiI (4 mg/ml)活细胞染料孵育15分钟,双重标记的内皮祖细胞被收集,用于下一步试验。5试验设计60只脾切除的ApoE-/- C57BL/6J雄性小鼠给予高胆固醇饮食喂养24周,然后应用随机数字表,将老鼠随机分为三组：Control组：尾静脉给予200μl无菌的PBS, Lenti-EGFP组：尾静脉给予200μl 1×106携带有空载质粒的内皮祖细胞,Lenti-CCR5组：尾静脉给予200μl 1×106携带有过表达CCR5质粒的内皮祖细胞。内皮祖细胞输注后,所有老鼠改为普通饮食,继续喂养6周后处死。6组织病理、免疫组化及免疫荧光检测油红O染色实验评价小鼠主动脉根处动脉粥样斑块面积,免疫组织化学染色方法分别检测人和小鼠冠状动脉处CCL5和CCR5的表达、小鼠主动脉根处平滑肌α肌动蛋白、单核/巨噬细胞、内皮细胞,、炎症因子IL-6、MMP9等表达。免疫荧光染色方法检测小鼠主动脉根处内皮细胞表达。7免疫化学检测小鼠给予内皮祖细胞移植后分别于0周和6周采集全血,高速离心后,收集血清。应用小鼠动脉粥样硬化相关的蛋白芯片检测动脉粥样硬化相关的22个炎症指标变化,Cluster version 3.0和Java Tree View version 1.60软件用于分析蛋白芯片的结果。倍数变化(FC)被用来确定对照组与治疗组之间炎症指标变化程度。NO代谢物试剂盒检测血清中硝酸盐和亚硝酸盐含量变化。酶联免疫吸附试剂盒检测小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、炎症因子IL-6的表达变化。8统计学分析所有统计学数据均使用SPSS 18.0软件分析。计量资料以均数土标准差表示,计数资料以数值和百分比表示。统计分析采用t检验、Oneway ANOVA或LSD post-hoc分析。当P<0.05被认为差异具有显著性统计学意义。结果1 CCL5和CCR5在人和ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块中的表达和分布情况免疫组织化学染色方法检测趋化因子CCL5在不同时期人类动脉粥样斑块中的分布和表达情况。结果发现：CCL5分别能够在无斑块(内膜,9.93±4.57%；中膜,0.43±0.29%；外膜：17.91±2.66%),有稳定斑块(内膜,22.18±3.37%；中膜,23.87±5.04%,外膜：28.31±4.42%)和不稳定动脉粥样斑块(内膜,23.38±3.23%；中膜,22.42±9.02%；外膜：43.37±0.67%)的冠状动脉中检测到。实时定量分析进一步显示：与无斑块的冠状动脉相比,有稳定斑块的冠状动脉中CCL5在血管内膜和中膜区域的表达明显增加(内膜,P<0.05；中膜,P<0.01),但是CCL5表达含量在不稳定斑块与稳定的斑块的血管内膜和中膜之间,并没有显著性差异(内膜,P=0.64；中膜,P=0.81)。此外,与无斑块或有稳定斑块的冠状动脉相比,不稳定斑块中CCL5在血管外膜区域的表达含量明显增加(P<0.05,P<0.01)。其次,我们检测了趋化因子CCL5在ApoE-/-小鼠不同时期动脉粥样斑块中的表达变化。结果发现：CCL5能够在无斑块(内膜,20.23±2.35%；中膜,19.86±4.75%；外膜：3.15±0.30%),有稳定斑块(内膜,33.09±3.91%；中膜,14.41±4.21%；外膜：3.33±0.30%),不稳定斑块(内膜,17.43±2.22%；中膜,36.73±0.45%；外膜：13.5±1.41%)的小鼠冠状动脉中被探及。进一步分析发现,与无斑块动脉相比,有稳定斑块的冠状动脉,CCL5在血管内膜区域的表达含量明显降低(P<0.01)。与无斑块或有稳定斑块的冠状动脉相比,CCL5在不稳定斑块的血管中膜和外膜区域的表达含量明显增加(中膜,P<0.05,P<0.01；外膜,P<0.01,P<0.01)。此外,我们检测了CCR5蛋白分别在人和小鼠冠状动脉组织中的表达变化。结果发现,CCR5能够明显在无斑块的动脉处探及,并且随着斑块面积的增加,其表达含量明显增加。2过表达CCR5增加EPCs向内皮损伤部位的归巢,动员取ApoE-/-小鼠主动脉根的冰冻切片,给予CD31免疫荧光染色,结果显示：在ApoE-/-小鼠主动脉根的内皮和内皮下层能明显观察到内皮祖细胞,提示内皮祖细胞能成功植入到血管壁内皮层。此外,过表达CCR5内皮祖细胞(Lenti-CCR5)组,内皮祖细胞在内皮损伤部位聚集的数量明显高于单纯内皮祖细胞(Lenti-EPCs)组,(13.0±1.4vs.2.3±0.5,P<0.01),提示CCR5过表达后能增加内皮祖细胞向动脉内皮损伤部位迁移能力。3过表达内皮祖细胞上CCR5对动脉粥样斑块稳定性影响油红O染色结果分析：与Control组(19.75±2.98%)或Lenti-EGFP组(18.72±2.52%)相比,Lenti-CCR5治疗组(9.58±1.51%)其斑块面积明显减少。免疫组化染色分析显示：与Control组(11.4±1.78%,P<0.01)或Lenti-EGFP组(7.76±2.37%,P<0.05)相比,Lenti-CCR5组(2.56±0.94%)巨噬细胞阳性染色面积明显减少。但是平滑肌α肌动蛋白阳性染色面积在Control、Lenti-EGFP (P=0.97)、Lenti-CCR5 (P=0.76)三组之间未见显著性统计学差异。总之,内皮祖细胞上过表达CCR5能够减少斑块部位脂质沉积和巨噬细胞的侵润,促进动脉粥样斑块的稳定。4过表达内皮祖细胞上CCR5降低高脂血症水平我们采用比色法检测了三组小鼠血清中血脂水平的变化。结果发现,与基线水平相比,Lenti-CCR5组血清中胆固醇和低密度脂蛋白水平明显降低(胆固醇数值：25.90±4.66 vs 12.14±2.50,P<0.05；低密度脂蛋白数值：4.11±0.85vs1.57±0.40,P<0.01)。血清中甘油三酯和高密度脂蛋白未见明显变化(甘油三酯水平：1.48±1.13 vs 0.68±0.15,P>0.05；高密度脂蛋白水平：4.18±0.38 vs3.66±1.10,P>0.05)。 Lenti-EGFP组血清中胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯和高密度脂蛋白治疗前后均未见明显性差异(P>0.05,P>0.05,P>0.05)。5过表达内皮祖细胞上CCR5对内皮功能的影响免疫组化评价三组小鼠主动脉根处内皮细胞的染色强度。结果发现,与Control组相比,Lenti-EGFP组内皮区域CD31染色呈无或低染色强度,而Lenti-CCR5组CD31染色呈中到高染色强度。此外,NO硝酸还原酶法结果显示,在EPCs治疗0天时,Control, Lenti-EGFP, Lenti-CCR5三组之间NO的含量没有显著性差异。6周治疗后,与Lenti-EGFP组相比,Lenti-CCR5组血清中NO含量明显增加(42.3±1.8 vs.36.6±2.8,P<0.05)。6过表达内皮祖细胞上CCR5降低炎症因子表达选取小鼠动脉粥样硬化抗体芯片,评价跟动脉粥样硬化相关的22个炎症因子的变化。结果发现：6周治疗后,与Control组相比,Lenti-CCR5组中有9个炎症因子变化呈倍比程度降低,分别是IL-6、IL-5、IL-3、IL-13、CD40和TNF-α,进一步分析发现炎症因子IL-6降低程度最高(FC=2)。我们采用酶联免疫吸附实验和免疫组化分别比较三组小鼠血液循环和动脉粥样斑块区域IL-6的表达变化,结果发现：与基线水平相比,循环血中IL-6水平在Lenti-CCR5组表达明显降低(P<0.05)。免疫组化染色结果发现,与Control或Lenti-EGFP组相比,IL-6阳性染色面积在Lenti-CCR5组显著性降低(Lenti-CCR5 vs Lenti-EGFP,13.07 ± 2.11% vs 24.3 ± 4.85%, P<0.05, Lenti-CCR5 vs Control,13.07 ± 2.11% vs 34.03 ±6.15%, P<0.01).此外,我们评价了斑块部位MMP9的表达变化,结果发现,与Control或Lenti-EGFP组相比,Lenti-CCR5组中膜区域MMP9阳性染色面积明显降低(Lenti-CCR5 vs Lenti-EGFP,16.26±2.14% vs 23.57±0.45%, P<0.01; Lenti-CCR5 vs control,16.26±2.14% vs 30.34±2.57%, P<0.01)。7统计学分析所有统计学数据均使用SPSS 18.0软件分析。计量资料以均数土标准差表示,计数资料以数值和百分比表示。统计分析采用t检验、Oneway ANOVA或LSD post-hoc分析。当P<0.05被认为差异具有显著性统计学意义。结论1.趋化因子CCL5和CCR5在人和小鼠动脉粥样硬化斑块中表达增加；2.过表达CCR5增加内皮祖细胞在动脉内皮损伤部位的聚集数量；3.过表达CCR5增加动脉粥样斑块的稳定性,减少动脉粥样斑块面积；4.过表达CCR5降低高脂血症小鼠血清中脂质水平；5.过表达CCR5改善内皮细胞功能障碍；6.过表达CCR5降低动脉粥样硬化小鼠全身和斑块局部的炎症反应；