研究目的：通过构建抑制ALDH2基因表达的腺病毒和ALDH2持续活化的突变体腺病毒，来证实ALDH2在IsoP诱导的心脏保护中所起到的关键作用，并确定ALDH2表达调控在功能上的重要性,研究方法(1)根据ALDH2基因序列及siRNA的设计原则，参考Cortinez,G的文献，设计小分子干扰RNA的序列，以ALDH2为靶基因设计并合成小发卡结构两端配对的siRNA寡核苷酸链，再经变性，复性后形成双链ALDH2-siRNA。采用DNA重组技术，将ALDH2-siRNA与线性化RetroQ载体连接，酶切鉴定后进行扩增，然后将Rat-ALDH2-siRNA从RetroQ-Rat-ALDH2(siRNA)上切下连接到pShuttle-Basic-ERFP重组穿梭载体，得到pShuttle-RFP-Rat-ALDH2-siRNA重组穿梭质粒，将pShuttle-RFP-Rat-ALDH2-siRNA转移到pAdeno载体上，得到pAdeno-RFP-Rat-ALDH2-siRNA病毒质粒。(2)以前的研究表明：持续活化的ALDH2487位氨基酸必须是谷氨酸而不是赖氨酸，Thr185、Thr412和Ser279需磷酸化。因此，我们通过在野生型大鼠ALDH2的cDNA引入突变Lys487Glu，Thr185Asp，Thr412Asp和Ser279Asp，获得了持续活化突变型ALDH2（CA-ALDH2），用DNA重组技术将CA-ALDH2基因连接到pShuttle-CMV-RFP重组穿梭载体，得到pShuttle-CA-ALDH2-RFP重组穿梭质粒；将pShuttle-CA-ALDH2-RFP转移到pAdeno载体上，得到pAdeno-CA-ALDH2病毒质粒。研究结果：(1)成功构建了以ALDH2基因为靶点的pAdeno-RFP-Rat-ALDH2-siRNA病毒载体，经酶切鉴定，所构载体无基因突变，结果与预期符合。(2)通过定点突变技术成功构建了pAdeno-CA-ALDH2病毒载体，经酶切鉴定，所构载体无基因突变，为下一步实验奠定了基础。研究结论：成功构建了pAdeno-RFP-Rat-ALDH2-siRNA病毒载体,Western blot结果表明该siRNA能很好的抑制ALDH2基因在大鼠心肌细胞中的表达；成功构建了pAdeno-CA-ALDH2病毒载体，Western blot结果表明该基因能在心肌细胞中持续表达。研究目的：以构建好的ALDH2干扰型和永久激活型腺病毒载体感染新生大鼠的心肌细胞，在基因水平特异性激活或抑制ALDH2，研究ALDH2在IsoP抗心肌细胞凋亡中的作用，并探索其抗凋亡机制。研究方法：将原代培养的1日龄新生SD大鼠心肌细胞随机同样地分成如下不同的实验组：空质粒感染同时异氟烷处理和未处理组；Adeasy-Si-ALDH2感染同时异氟烷处理和未处理组以及Adeasy-CA-ALDH2感染同时异氟烷处理和未处理组。使用含0.5mM异氟烷（大约1.0肺泡最小浓度）的0.5％FBS的DMEM培养细胞5分钟，进行IsoP。在缺氧处理前迅速除去含异氟烷的培养基并用PBS洗涤细胞。低氧室中培养离体的新生大鼠心肌细胞24h后供氧12h以模拟I/R制备H/R模型。H/R结束后采用免疫印迹法(WesternBlot)检测各实验组凋亡通路蛋白Cleaved caspase-3和FL-caspase-3的表达、用Caspase-3比色测定试剂盒检测细胞裂解产物中的caspase-3酶活性、用TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平以及用Cytotoxicity Detection Kit(LDH)检测心肌细胞培养基中的LDH释放量。综合上述指标评估ALDH2下调或活化在IsoP抗心肌细胞凋亡损伤中的作用。研究结果：IsoP通过激活AlDH2缓解了体外H/R损伤诱导的心肌细胞凋亡：缺氧24h复氧12h后，与未经H/R处理的心肌细胞相比，H/R处理显著升高了心肌细胞的凋亡指数（图1B）、凋亡通路蛋白酶Cleaved Caspase3的相对表达（图1C）、Caspase3活性（图1D）和LDH释放（图1E），TUNEL染色，可见DNA碎片增加，即明显的心肌细胞凋亡。IsoP显著降低了Ad-RFP感染组H/R诱导的心肌细胞的凋亡指数、Cleaved Caspase-3的相对表达、Caspase3活性和LDH浓度的升高（P﹤0.05，图1B-E）。然而在Ad-Si-ALDH2感染组中，由Ad-Si-ALDH2介导ALDH2基因下调使ALDH2蛋白表达水平降低的情况下（图1A），IsoP不能降低H/R诱导的心肌细胞的凋亡指数、Cleaved Caspase-3的相对表达、Caspase-3活性和LDH释放的显著升高（P﹥0.05，图1B-E），即Ad-Si-ALDH2介导ALDH2基因下调后取消了IsoP的上述心脏保护作用，IsoP与未处理组无显著差异。上述结果表明：IsoP显著抑制了H/R诱导的心肌细胞凋亡，而ALDH2基因下调则抑制了IsoP诱导的抗心肌细胞凋亡的作用。这一结果支持我们的假设即ALDH2可能在IsoP诱导的心肌保护中发挥关键作用。免疫印迹分析表明，与Ad-RFP感染的细胞组相比，Ad-CA-ALDH2-RFP感染的细胞组中的ALDH2水平大幅度增加（图2A）。持续活化的ALDH2显著抑制H/R引起的TUNEL阳性染色的增加，Caspase-3活性的增加和LDH的释放（P﹤0.05，图2B-E，）。而在Ad-CA-ALDH2介导ALDH2持续活化的情况下，再用IsoP则不能进一步增强上述心脏保护作用,即IsoP与未处理组无差异。这说明了活化的ALDH2（即磷酸化的ALDH2）参与IsoP诱导的心脏保护作用。研究结论：IsoP通过激活AlDH2缓解了体外H/R损伤诱导的心肌细胞凋亡。ALDH2基因下调,H/R后心肌细胞凋亡数目大大增加，持续活化的ALDH2（即ALDH2基因上调）显著抑制H/R引起的心肌细胞凋亡，这表明活化的ALDH2参与了IsoP诱导的心肌保护作用。这一结果支持我们的假设即磷酸化ALDH2可能在IsoP诱导的心肌保护中发挥关键作用。ALDH2的抗心肌细胞凋亡作用的机制可能与其抑制Caspase3的激活从而抑制凋亡通路的激活有关。研究目的：通过ALDH2激动剂及抑制剂，在药理水平激动或者抑制ALDH2，研究内源性ALDH2及其特异位点磷酸化在IsoP抵抗在体MIRI中的作用。研究方法：采用结扎冠状动脉左前降支(LAD)40分钟之后进行120分钟再灌注处理制备雄性SD大鼠心肌I/R模型。为了证实异氟烷诱导的ＡＰＣ作用，从大鼠稳定期开始，以最小肺泡浓度1.0（2.1%）的异氟烷开始持续吸入30分钟，之后进行30分钟洗脱，再进行冠状动脉闭塞处理。根据不同的处理方法将大鼠随机分配到下列各组：假手术对照组和IsoP的假手术对照组：无/有IsoP，开胸分离冠状动脉左前降支，仅在LAD下穿线，但不阻断血流,持续160分钟(每组5只)；缺血再灌注组和IsoP的缺血再灌注组：无/有IsoP，可逆性的结扎LAD造成区域性心肌缺血40分钟，再灌注120分钟(每组5只)；为了评估ALDH2磷酸化在异氟烷诱导的心脏保护中的作用，在IsoP和无IsoP缺血处理前5分钟分别给予ALDH2的激活剂Alda-44（40μM）（每组8只），和ALDH2抑制剂cyanamide（5mM），（每组8只）。再灌注结束后，取出心脏采用伊文思蓝和TTC双重染色法测定心肌梗死面积。取出心脏前采集5ml血样，LDH和CK-MB的浓度用全自动生化分析仪7600及商用试剂盒进行测定；采用免疫印迹法测定信号通路蛋白(磷酸化的ALDH2and总ALDH2)的表达。研究结果：(1)IsoP诱导的心脏保护作用：与假手术对照组相比，结扎LAD引起区域性心肌缺血40分钟然后进行120分钟再灌注使I/R组大鼠的血清LDH和CK-MB浓度和心梗面积显著增加(P<0.01)。而IsoP诱导的APC作用显著地降低了I/R所导致的心肌细胞LDH和CK-MB释放且大幅度地减少了I/R-诱导的心肌梗死面积（P<0.05）见图1；(2)ALDH2的磷酸化参与IsoP诱导的心脏保护:与I/R对照组相比，IsoP后使心肌细胞中磷酸化的ALDH2浓度显著升高（P<0.01），即缺血前IsoP增加了ALDH2的磷酸化。而ALDH2酶抑制剂cyanamide显著抑制了异氟烷诱导的ALDH2磷酸化后的激活效应（P<0.05）。使用ALDH2的直接激活剂Alda-44大幅度地增加了心肌细胞中ALDH2的磷酸化水平（P<0.01），但Alda-44并没有使IsoP诱导的ALDH2磷酸化效应进一步增强（图2A）。与ALDH2磷酸化相一致，我们观察到IsoP和使用Alda-44均显著减少了I/R引起的心肌细胞LDH和CK-MB向血浆的泄漏并减少了心梗面积（P<0.01，图2B-D）。IsoP和同时使用Alda-44不能进一步增强这种降低，即二者无叠加效应。然而，IsoP诱导的减少LDH和CK-MB释放和减少了心梗面积效应可明显被ALDH2抑制剂氰胺所阻断（P<0.01，图2B-D）。这些研究结果表明IsoP介导的心脏保护主要是由激活ALDH2所引起。研究结论：IsoP诱导的APC作用显著减少了大鼠心脏I/R损伤所致的LDH和CK-MB释放，通过增加ALDH2的磷酸化减少了I/R-诱导的心肌梗死面积。我们推测IsoP介导的心脏保护可能主要是由激活ALDH2所引起。研究目的：通过WesternBlot检测PKC两种亚型（PKCε和PKCδ）的线粒体转位，确定PKC两种亚型在IsoP抗MIRI中的活化情况；通过加入PKC两种亚型的抑制剂，研究PKC双亚型在ALDH2介导的IsoP抗MIRI中的作用。从而探索PKC信号通路与ALDH2分子的内源性信号转导途径与分子调控机制。研究方法：(1)为了验证PKCε参与ALDH2的磷酸化，在IsoP和无IsoP缺血处理前5分钟给予雄性SD大鼠PKCε抑制剂PKCεV1-2（1μM）（每组8只），分别测定各实验组（I/R组、I/R+IsoP组、I/R+εV1-2组和I/R+IsoP+εV1-2组）大鼠的血清LDH和CK-MB的浓度，并用伊文思蓝-TTC双染色法测定心梗面积，并计算出心梗面积的百分比。Westernblot测定信号通路蛋白（Phos-ALDH2和Total-ALDH2、Mito-PKCε与Total-PKCε）的表达；(2)为了探讨IsoP对PKCδ的活化及向线粒体转位的影响，分别测定各实验组（SHAM组、I/R组、SHAM+IsoP组和I/R+IsoP组）的Mito-PKCδ和Total-PKCδ的表达量。（3）为了探讨PKCδ在ALDH2磷酸化中的作用，在IsoP和无IsoP缺血处理前5分钟给予PKCδ的抑制剂Rottlerin（1μM）（每组8只）。分别测定各实验组（I/R组、I/R+IsoP组、I/R+rottlerin组和I/R+IsoP+rottlerin组）大鼠血清中LDH和CK-MB的浓度。Westernblot测定信号通路蛋白（Phos-ALDH2和Total-ALDH2）的表达。研究结果：(1)PKCε参与了IsoP诱导的ALDH2的磷酸化和心脏保护：PKCε转位到线粒体后使ALDH2磷酸化是保护心脏免受I/R损伤的必需步骤。与未经IsoP的I/R对照组相比，IsoP后心肌细胞线粒体中的PKCε浓度显著升高（P<0.01）同时伴有心肌细胞中磷酸化的ALDH2浓度显著升高（P<0.01），而PKCε抑制剂εV1-2能显著抑制这种升高（P<0.01）。在此，我们证明：IsoP导致PKCε在线粒体中浓度升高且伴随着ALDH2的磷酸化。IsoP介导的ALDH2的磷酸化被PKCε抑制剂εV1-2所抑制。由于PKCε在线粒体中的转位迅速发生，导致细胞质基质PKCε水平相应下降，因为细胞总的PKCε水平没有发生变化（图1A），因此我们的数据表明IsoP使PKCε动态转位到线粒体上以应对I/R引起的损伤。与PKCε转运到线粒体的情形相对应，PKCε抑制剂εV1-2取消了IsoP诱导的减少LDH和CK-MB释放效应以及减少心肌梗死面积的效应(图1B-D)；(2)IsoP减少了心肌细胞的PKCδ的活化及向线粒体转位：我们的数据表明：与假手术对照组相比，I/R导致心肌细胞线粒体中的PKCδ浓度显著增高（P﹤0.01），IsoP后大大减少了心肌细胞中的PKCδ向线粒体转位使心肌细胞线粒体中的PKCδ浓度显著降低（P﹤0.01）（图2A-B）（3）PKCδ向线粒体转位减少参与了IsoP诱导的心脏保护：IsoP减少了PKCδ从胞浆转位到线粒体中，PKCδ抑制剂rottlerin显著抑制了I/R导致的心肌细胞ALDH2磷酸化水平的降低（图3A-B）以及LDH和CK-MB释放（图3C-D），其效果与IsoP相当免疫印迹分析结果表明：使用PKCδ抑制剂rottlerin抑制了PKCδ的活性后,无论是否施用IsoP，I/R损伤后ALDH2磷酸化水平都显著升高。类似地，IsoP使PKCδ的活性被抑制从而使PKCδ线粒体移位减少以应对I/R引起的心肌损伤。研究结论：IsoP导致PKCε在线粒体中的浓度显著升高且伴随着ALDH2的磷酸化，同时减少PKCδ的线粒体移位，通过双向调节PKC双亚型（PKCε和PKCδ）通路在心肌I/R过程中的活化水平，从而进一步激活了ALDH2，抵抗了心肌I/R损伤。即IsoP诱导的抗心肌I/R损伤机制可能是通过激活PKC（PKCε和PKCδ）-ALDH2信号通路实现的。