研究背景:支气管哮喘（简称哮喘）是一种难治的肺疾病,困扰着全球数亿的患者。气道炎症反应的持续进展是气道重构等哮喘病生理学的主要特征。研究表明,气道上皮粘膜损伤后得不到及时修复是导致炎症反应持续存在的原因之一。因此恢复完整的气道上皮黏膜,终止损伤的上皮细胞对哮喘气道炎症反应的促进作用至关重要。大量研究表明,气道黏膜存在着上皮祖细胞Club细胞,能够增殖或分化成纤毛细胞重建受损的支气管上皮屏障。细胞自噬是一种应激反应诱导的细胞自我保护机制,已有研究提示,哮喘发生与细胞自噬缺失有关,葡萄糖剥夺可诱导细胞自噬,细胞自噬激活后可反馈调节细胞的葡萄糖摄取。那么在哮喘的炎症反应中,细胞自噬和葡萄糖代谢对Club细胞功能有怎样的调控作用,是否会影响其增殖和分化功能,以及如何参与气道上皮损伤后的修复进程,是本研究的主要内容。研究方法:本研究采用流式细胞分选结合体外3D类器官培养的方法,通过统计细胞的克隆形成率和克隆直径研究Club细胞的增殖情况;用RT-PCR的方法,从m RNA水平分析Club细胞的分化情况;野生型小鼠流式分选出Club细胞,通过在其体外3D类器官培养中增添小分子自噬激活剂（Spermidine）或小分子自噬抑制剂（3-MA,Bafilomycin）,或利用Scgb1a1-cre ER;Atg5^f/f转基因小鼠模型敲低自噬基因Atg5,研究自噬对Club细胞增殖和分化的影响;采用2-NBDG荧光示踪法,研究细胞自噬对Club细胞葡萄糖摄取的调控;利用Scgb1a1-cre ER;Glut1^f/f转基因小鼠模型敲低Glut1或者调节培养基中的葡萄糖的浓度,研究葡萄糖摄取对Club细胞增殖分化的影响;通过在培养基中加入小分子糖酵解通路抑制剂2-DG,研究葡萄糖代谢对Club细胞增殖分化的影响。研究结果:1.流式分选野生型小鼠Club细胞,经体外3D类器官培养,表明小分子自噬激活剂（Spermidine）对于Club细胞的增殖能力有促进作用,对于其向纤毛细胞和杯状细胞的分化有抑制作用;自噬抑制剂（3-MA或Bafilomycin）抑制Club细胞的增殖,促进其向纤毛细胞和杯状细胞分化。流式分选Scgb1a1-cre ER;Atg5^f/f小鼠（tamoxifen预处理）的Club细胞进行体外3D类器官培养,与对照组Atg5^f/f小鼠相比,自噬基因Atg5敲低抑制Club细胞的增殖,促进其向纤毛细胞和杯状细胞的分化。2.采用2-NBDG荧光示踪法比较Scgb1a1-cre ER;Atg5^f/f小鼠Club细胞与Atg5^f/f小鼠Club细胞的摄糖情况,结果显示,自噬基因Atg5敲低后,Club细胞对葡萄糖的摄取能力有下降趋势。3.利用Scgb1a1-cre ER;Glut1^f/f条件性敲除小鼠模型选择性敲低Club细胞Glut1基因,发现Glut1敲低导致Club细胞增殖能力下降,向纤毛细胞和杯状细胞的分化增强。4.体外3D类器官培养发现,逐渐降低葡萄糖浓度促进Club细胞增殖,向纤毛细胞和杯状细胞分化减弱。但是进一步降低甚至剥夺葡萄糖,Club细胞增殖能力下降,加速向纤毛细胞和杯状细胞分化。低浓度糖酵解抑制剂2-DG促进Club细胞增殖;高浓度2-DG情况下Club克隆增殖下降,向纤毛细胞和杯状细胞的分化增强。研究结论:细胞自噬促进Club细胞的增殖,抑制其向纤毛细胞和杯状细胞的分化。自噬基因Atg5敲低后,Club细胞的葡萄糖摄取能力有降低趋势。Glut1基因敲低、阻断糖酵解或葡萄糖剥夺抑制Club细胞的增殖,促进其向纤毛细胞和杯状细胞的分化。这些结果证明细胞自噬和葡萄糖代谢在气道祖细胞即Club细胞再生修复上皮黏膜中发挥重要作用。