论文部分内容阅读
精子是一类功能十分特化的细胞,传统认为精子的作用主要是作为父源性遗传物质的载体以及激活胚胎受精后发育。研究发现在受精过程中,精子进入卵母细胞时带入了mRNAs、microRNAs、tRNAs以及siRNAs等物质,它们对雌雄原核形成、卵母细胞激活、卵裂球分裂时空顺序、胚胎发育能力以及后代表型等都有着重要影响。而microRNA是在真核生物中发现的一类内源性且具有调控功能的单链非编码RNA,主要通过与靶基因3?-UTR区进行碱基配对来降解或者抑制靶基因的表达。已有报道精子带入卵母细胞内的microRNA对于胚胎发育有着重要的调控作用,然而精子microRNA在受精作用和胚胎发育中的功能仍然未知。因此,系统的研究受精过程中精子带入卵母细胞的microRNA将有助于完善我们对早期胚胎发育的认识。课题组利用新一代高通量测序技术分别构建了牛成熟精子、MⅡ期卵母细胞和牛成纤维细胞的small RNA文库,并且通过实时定量PCR的方法进行了验证。通过生物信息学方法,筛选出精子特异性且高表达的microRNA:Bta-miR-202,通过在线数据库预测并取交集,在NCBI上查找基因序列,发现有与Bta-miR-202结合的种子序列,从这些序列中我预测了13个候选靶基因。通过构建双荧光素酶报告载体和表达载体,进行双荧光素酶报告实验后发现SEPT7基因的野生型3?-UTR区域受到miR-202 mimic的抑制;在3?-UTR区域上进行点突变后,mi R-202 mimic对SEPT7突变的3?-UTR区域抑制程度减弱;通过定量PCR发现miR-202mimic可以降低SEPT7基因转录的mRNA水平,通过Western Blot确定miR-202能抑制SEPT7基因的翻译。综合双荧光素酶报告实验、实时定量PCR和Western Blot的实验结果可以得出:SEPT7基因是mi R-202的靶基因。将miR-202通过显微注射的方法注入卵母细胞内,发现卵裂率较对照组显著提高,SEPT7表达量下调。孤雌及体外受精胚胎各时期定量发现,受精后SEPT7的表达量较MⅡ期以及孤雌激活后的胚胎会有一个极显著的下调;在体外受精各时期中,SEPT7和mi R-202的表达量呈负相关,推测两者可能存在负反馈调节机制。总之,本研究梳理了精子特异性且高表达的microRNA,并通过一系列生物信息学手段以及分子手段预测并验证了miR-202的靶基因:SEPT7。通过显微注射发现miR-202对卵裂有重要影响,而定量结果也显示,SEPT7在受精后的胚胎中有显著变化,两者可能存在负反馈调节机制。本研究表明精子中特异性且高表达的miR-202对早期胚胎发育具有重要影响。