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万隆霉素是我国拥有自主知识产权的有效防治植物卵菌病害的农用抗生素,其有效成分结构鉴定为含两个2-羧基-喹喔啉发色的环缩肽新结构化合物。本文对新农抗万隆霉素的发酵产物进行高效液相色谱法测定,并对其产生菌的链霉素抗性菌株进行氮离子注入诱变筛选万隆霉素高产菌株的研究,得出以下结论:
1.采用反相高效液相色谱(HPLC)法测定发酵产物中万隆霉素的含量,结果显示色谱柱为C<,18>反向分析柱(3.9×1.50mm),柱温为40℃,流动相为甲醇:水(20:80,V/V),检测波长为280nm,流速为1mL/min时,能快速有效地测定发酵产物万隆霉素的含量,万隆霉素浓度在0~280μg/mL范围内线性良好,线性回归方程为y=13170x+28665,相关系数R<2>=0.9995(n=5)。
2.用不同能量(10、20、30KeV)和不同剂量(7.8×10<14>、13×10<14>、18.2×10<14>、23.4×10<14>、28.6×10<14>ions/cm<2>)的氮离子对万隆霉素产生菌的链霉素抗性菌株进行诱变。结果发现氮离子注入能量为20KeV,剂量为23.4×10<14> ions/cm<2>时的诱变效率较高,正突变率达到了39.96%,由此筛选出比出发菌株效价提高了82.10%的较高产菌株。氮离子注入能量为20 Kev,剂量为28.6×10<14>ions/cm<2>时诱变产生5种形态差异较大的突变株。分别为A、B、C、D、E型, A型菌株菌落约0.6cm,草帽型,透明不产色素,不产孢子;B型菌株菌落约0.5cm,菌落扁平,产黄色色素,孢子较少;C型菌株菌落约0.8cm,白色突起,不产色素,孢子较多;D型菌株菌落约0.8cm,内凸,外周白色,孢子较少;E型菌株菌落约0.8cm,菌落上凸,产黄色色素,孢子较少。出发菌株产素效价为148.95μg/mL;A型菌株产素效价为79.75μg/mL;B型菌株产素效价为152.43μg/mL;C型菌株产素效价为216.69μg/mL;D型菌株产素效价为171.27μg/mL;E型菌株产素效价为126.86μg/mL。
3.分别用氮离子、微波和紫外光对万隆霉素产生菌的链霉素抗性菌株进行诱变,筛选万隆霉素高产菌株。结果表明万隆霉素产生菌的链霉素抗性菌株对氮离子、微波和紫外光诱变都很敏感。氮离子诱变的效率较好,其诱变筛选出的较高产菌株WN939效价提高了82.10%:微波诱变的次之,其诱变筛选出的较高产菌株WW578的效价提高了31.76%;紫外光诱变的效果较差,其诱变筛选出的较高产菌株WZ461的效价提高了20.55%。菌株WN939和WW578遗传较稳定,而菌株WZ461有恢复突变的趋势。因此提出对万隆霉素产生菌的链霉素抗性菌株较适合的诱变路线为:首先用氮离子诱变筛选出产素稳定的高产菌株,然后用微波诱变筛选出产素稳定的高产菌株,最后用紫外光诱变筛选出产素稳定的高产菌株。