茶树PPO基因表达调控中转录因子的筛选与功能研究

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多酚氧化酶(PPO)是茶树中一类重要的末端氧化酶,它不仅在茶树的生理代谢中起到重要作用,而且在红茶加工过程中,对于催化多酚类物质的氧化起着主导作用。但是,茶树中PPO基因的功能及其转录调控机理尚未明晰。本文以不同PPO酶活性的茶树品种为材料,通过转录组测序和PCR筛选得到一个调控PPO基因表达的CsbHLH51转录因子,设计引物并克隆CsbHLH51转录因子和CsPPO1、CsPPO2的启动子序列,然后采用双荧光素酶系统对CsbHLH51转录因子功能进行了验证。主要研究结果如下:1、对获得的茶树3大类转录因子bHLH、WRKY和MYB进行初步的生物信息学分析。从茶树转录组中分别筛选获得82个bHLH的转录因子,55个WRKY的转录因子和60个MYB的转录因子。进化树结果表明,茶树bHLH可分为9个亚组,其中XII数量最多,CsbHLH51属于Vb亚类。茶树WRKY可分为I、II、III三个大类,其中II类的数量最多。茶树MYB转录因子可分为R2R3、3R和4R三个大类,其中大多属于MYB-R2R3类。2、生物信息学分析表明,茶树CsPPO1和CsPPO2基因分别编码595个氨基酸和612个氨基酸,均含有PPO家族特有的PPO1_DWL结构域、Tyrosinase结构域和PPO1_KFDV结构域。序列分析表明均为亲水性蛋白,不存在信号肽,属于非分泌蛋白。从二级结构分析,两个蛋白都含有α-螺旋、β-折叠和大量的无规则卷曲结构。通过顺式元件分析,发现CsPPO1和CsPPO2基因的启动子分别包含两个和三个E-box元件,即存在可能与bHLH转录因子进行特异性结合的位点,同时也含有参与很多其他植物生理发育过程的顺式元件。3、CsbHLH51转录因子全长837bp,编码279个氨基酸,分子量为30.94k Da。亚细胞定位实验表明CsbHLH51定位于细胞核,属于核蛋白。构建CsbHLH51-pBD载体,通过REN/LUC比值证明CsbHLH51存在自激活活性,是一个激活子。双荧光素酶报告基因系统实验证明CsbHLH51可能通过与CsPPO1和CsPPO2的启动子上的元件结合对下游基因产生了激活作用。
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