造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）通过自我更新和分化维持造血系统稳态,转录（辅助）因子是调控HSCs命运的关键因素。本文就转录因子THAP11及转录辅助因子EDAG在HSCs中的作用机制进行了研究。THAP11是THAP转录因子家族成员,已报道THAP11对于多器官发育是至关重要的,但THAP11在造血系统中的生理功能尚不清楚。本实验室前期发现在造血系统特异敲除THAP11致小鼠胚胎致死,HSCs体外成集落能力下降,重建造血能力降低。RNA-Seq分析发现THAP11可调控线粒体功能及氨基酸代谢等相关基因表达。本论文通过构建代谢相关基因包括Acad8、Bckdk、Aldh6a1、Tha-1、Mrp124、5×TBS等启动子报告基因载体,采用双荧光素酶报告基因实验分析THAP11对靶基因启动子的调控作用。结果表明THAP11以剂量依赖的方式增强了靶基因启动子活性,突变基因启动子区THAP11潜在结合位点后THAP11对启动子的调控作用显著降低;EMSA实验证实THAP11可在体外与靶基因启动子特定位点结合,这些结果表明THAP11通过直接结合靶基因启动子特定位点调控靶基因表达。进一步利用Western blot检测了 THAP11对缬氨酸代谢相关基因Acad8及Bckdk蛋白质水平的影响,发现过表达THAP11可增强内源Acad8及Bckdk蛋白质的表达水平,在小鼠骨髓c-Kit+细胞中诱导敲除THAP11可显著下调Acad8及Bckdk蛋白质表达,表明THAP11可直接调控缬氨酸分解代谢相关基因Acad8及Bckdk的表达。此外,THAP11F80L突变后对靶基因启动子的激活作用明显减弱,提示THAP11调控靶基因表达依赖于其THAP结构域。实验室前期对THAP11相互作用蛋白质进行了筛选,获得一种造血细胞特异表达的转录辅助因子EDAG。构建EDAG敲除小鼠模型证实EDAG敲除不影响造血系统发育,但在移植条件下,EDAG敲除的HSCs不能有效植入受体,丧失重建造血能力。RNA-Seq结果显示EDAG敲除引起IFN-γ信号通路相关基因表达上调,提示EDAG可能是HSCs中IFN-γ通路的重要负调控因子,但EDAG如何调控IFN-γ信号通路并不清楚。本论文对EDAG负调控IFN-γ通路的分子机制进行了深入探讨。首先,分选EDAG敲除小鼠及对照小鼠骨髓c-Kit+细胞,检测IFN-γ刺激条件下Stat1（Tyr701）及Stat1（Ser727）的磷酸化水平。结果表明在造血干/祖细胞内敲除EDAG并不影响Stat1（Tyr701）的起始磷酸化,但促进了 p-Stat1（Tyr701）水平的维持,并对p-Stat1（Ser727）水平无明显影响。利用人K562细胞敲低内源EDAG也获得同样的结果。分离胞浆胞核蛋白,发现EDAG敲除后p-Stat1（Tyr701）的增强发生在胞核。免疫共沉淀实验发现EDAG/Stat1/TC45存在相互作用,并且EDAG可以增强Stat1/TC45之间的相互作用。TC45的特异抑制剂ⅩⅨ减弱EDAG敲除导致的p-Stat1（Tyr701）水平升高。这些结果提示EDAG通过募集TC45分子促进细胞核内Stat1的去磷酸化,进而在IFN-γ信号通路中发挥负调控作用。本部分工作作为重要结果在Advanced Science发表。综上,本论文对转录因子THAP11及转录辅助因子EDAG在HSCs中的作用机制进行了研究,揭示了 HSCs新的调控机制,为后续深入研究两者相互作用奠定了基础。