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目的:本实验基于iTRAQ蛋白质组学研究技术,以16月增龄小鼠为实验对象,通过比较分析3月龄和16月龄雌、雄小鼠肝脏线粒体中蛋白质的变化规律,挖掘衰老密切相关的蛋白质标志物,探究四君子汤对衰老相关蛋白生物标志物的影响,从而从蛋白质组学的角度阐释衰老的发生发展机制及四君子汤干预小鼠增龄相关证候的生物学基础,为方证关系研究提供科学依据。方法:基于本课题组前期研究基础上,选取3月龄SPF清洁级ICR雌、雄小鼠各10只做为空白组,16月龄ICR雌、雄小鼠各20只,随机分为四君子汤组和模型组,每组雌雄小鼠各10只。四君子汤组采用浓缩药液灌胃(剂量约为9.75g/kg·d),其余各组予以同体积比生理盐水灌胃。于给药后第31天将小鼠以颈椎脱位法处死后摘取肝脏,所取样本经标记后用液氮速冻,立即存于-80℃冰箱冻存备用。从肝脏中提取线粒体样本,以同位素标记相对和绝对定量技术,研究自然增龄模型小鼠肝细胞线粒体蛋白生物标志物的变化情况。结果:1.基于蛋白质组学ITRAQ技术分析发现,模型小鼠的肝细胞线粒体中存在与增龄相关的蛋白质生物标志物,经过四君子汤干预后出现了回调主要包括:胶原α-5(VI)链(Collagen alpha-5(VI)chain)、葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase)、整合素α-9(Integrin alpha-9)、非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Non-specific serine/threonine protein kinase)、透明质酸酶(Hyaluronidase)、鸟嘌呤核苷酸交换因子(Guanine nucleotide exchange factor VAV2)、40S 核糖体蛋白 S15(40S ribosomal protein S15)、细胞色素 P450 2J6(Cytochrome P450 2J6)等。2.将受到四君子汤干预的蛋白标志物进行Gene Ontology分析,发现四君子汤对衰老相关蛋白标志物的干预作用主要体现在蛋白运输(protein transport)、类固醇代谢过程(steroid metabolic process)、核糖体分解(ribosome disassembly)、自噬(autophagy)、溶酶体(lysosome)、线粒体(mitochondrion)、核糖体(ribosome)、内质网(endoplasmic reticulum)、水解酶活性(hydrolase activity)、催化活性(catalytic activity)、转移酶活性(transferase activity)等方面。3.蛋白标志物通过KEGG PATHWAY通路富集分析后发现,四君子汤对衰老相关蛋白的干预作用主要与代谢途径(Metabolic pathways)、内吞作用(Endocytosis)、粘着斑(Focal adhesion)、剪接体(Spliceosome)、阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease)、亨廷顿病(Huntington’s disease)、ECM 受体相互作用(ECM-receptor interaction)、核糖体(Ribosome)、肥厚性心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy,HCM)、细胞凋亡(Apoptosis)、mTOR 信号通路(mTOR signaling pathway)等相关。结论:1.16月龄模型组小鼠与3月龄空白组小鼠相比,发现肝组织样本中蛋白标志物存在显著差异,表明自然增龄可引起小鼠蛋白标志物及相关的生物通路改变。2.通过蛋白质组学技术研究发现,四君子汤对16月龄小鼠肝组织代谢途径、内吞作用、粘着斑、剪接体、阿尔茨海默病、亨廷顿病、ECM受体相互作用、核糖体、肥厚性心肌病(HCM)、细胞凋亡、mTOR信号通路等途径具有调节作用。通过调节这些信号通路的相关蛋白,进而对增龄产生的相关机体功能紊乱起到保护和调节作用。3.经过蛋白标志物的GO分析发现,四君子汤主要调节了蛋白运输、类固醇代谢过程、核糖体分解、自噬等多种生物过程,影响了溶酶体、内质网、线粒体、核糖体等重要细胞组分,参与了水解酶活性、转移酶活性、催化活性等分子生理功能的调节。