论文部分内容阅读
心肌梗死(MI)后发生心肌纤维化,其主要病理改变为心肌细胞肥大、成纤维细胞增生、胶原合成异常和过度沉积,可导致心肌僵硬度增加、心室舒张收缩功能减退、电生理紊乱、心律失常、冠状动脉储备下降,甚至引起猝死。心肌纤维化的机制较为复杂,多种细胞因子和生长因子均参与心肌纤维化的发生和发展,其中研究最多、作用最明显的是转化生长因子-β1(TGF-β1),TGF-β1的表达与MI后心肌纤维化密切相关。TGF-β1是一种强效的致纤维化因子,在心肌纤维化时表达增加,是目前抗纤维化治疗的标靶。骨形态发生蛋白-7(BMP-7)是TGF-β因子超家族的另一成员,研究表明,BMP-7与TGF-β1具有非常相似的信号转导机制,在纤维化的形成中相互拮抗,共同调节纤维化的发生和发展。目前国内外尚无BMP-7对心梗后心肌纤维化的影响及其作用机制的研究报道。本研究旨在:(1)探讨重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞(CFs)增殖和胶原合成的影响及作用机制;(2)通过腹腔注射rhBMP-7,并与贝那普利进行比较,观察其对心梗后心肌纤维化及左室重构的影响。一、新生大鼠心肌成纤维细胞的培养及鉴定目的:在正常心脏,非心肌细胞约占心脏细胞总数的三分之二,其中90%以上是CFs。CFs不仅是胶原分泌的靶细胞,也是心肌纤维化的效应细胞,在心肌细胞外基质(ECM)形成和心肌纤维化发生发展过程中起关键作用。TGF-β1是导致心肌纤维化诸多因素最后的共同中介之一,对心肌成纤维细胞增殖、分化、迁移和细胞外基质的沉积均有重要的作用。本实验中,我们通过体外培养新生大鼠CFs,观察TGF-β1干预对CFs增殖的影响,为直接研究相关细胞因子与心肌纤维化之间的关系提供物质基础,为开展药物对CFs增殖影响的实验提供可靠保证。方法:采用胰酶消化法结合差速贴壁法培养原代CFs。以第2-3代细胞用于实验。通过细胞形态观察和免疫组织化学染色鉴定CFs的纯度;台盼蓝染色检测细胞活性;噻唑蓝比色法(MTT法)检测CFs增殖。结果:(1)显微镜下观察可见培养的CFs呈不规则三角形,胞质淡而几乎透明,折光弱,细胞核较大,呈椭圆形,通常含2-3个核,无自发性搏动。台盼蓝染色活细胞数大于97%。免疫细胞化学染色波形蛋白染色呈阳性,血管平滑肌肌动蛋白染色呈阴性,PBS对照呈阴性,符合CFs的染色特征,鉴定为所需的CFs,纯度达98%。(2)MTT法测定TGF-β1对CFs增殖的影响,结果显示,在1-100ng/ml之间的TGF-β1促进了CFs的增生,作用呈浓度依赖性,其中以10 ng/ml时光密度值(OD)最大,与对照组比较差异十分显著(P<0.01);以10ng/ml浓度的TGF-β1作用于CFs 24 h,48 h,72h,CFs增殖呈时间依赖性,48h和72h的OD值最大,与对照组比较差异十分显著(P<0.01)。结论:上述结果显示,通过胰酶消化结合差速贴壁法可获高纯度的新生大鼠原代CFs;TGF-β1促进CFs增殖呈浓度依赖性和时间依赖性,选取10ng/ml、48h作为下一步实验中TGF-β1的浓度和作用时间。二、rhBMP-7对TGF-β1诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及机制探讨目的:本部分实验中,我们观察了不同浓度rhBMP-7干预对TGF-β1诱导的CFs增殖和胶原合成的影响,以期从细胞水平上探索rhBMP-7是否具有预防和逆转心肌纤维化的作用;并加入BMP-7下游信号蛋白Smad5的阻滞剂Jab-1,观察CFs增殖、胶原合成及下游信号蛋白表达的变化情况,探讨rhBMP-7减轻心肌纤维化的可能机制。方法:取第2-3代CFs用于实验。待细胞生长至80%融合时,吸去原培养液,PBS洗涤2次,血清饥饿24h后按分组不同分别加入不同剌激因素处理48h:(1)TGF-β1阳性对照组:TGF-β(110ng/ml);(2)rhBMP-7和TGF-β1共处理组:rhBMP-7(1,10,100ng/ml)+ TGF-β1(10ng/ml);(3)rhBMP-7和Jab-1共处理组:Jab-1(20ng/ml)+ rhBMP-7(1,10,100ng/ml)+ TGF-β1(10ng/ml)。采用MTT法测CFs生长数目,ELISA检测I、III型胶原的含量,Real Time-PCR和Western-Blot分别检测Smad2、Smad3、CTGF mRNA和蛋白水平的表达。结果:(1)细胞计数法测定rhBMP-7对TGFβ1诱导的CFs增殖的影响,结果可见:rhBMP-7在浓度为1-100ng/ml范围内可显著抑制CFs增殖,不同浓度的rhBMP-7组CFs的细胞计数均有不同程度的下降,并随浓度增加细胞数下降更明显,呈浓度依赖性,100ng/ml浓度组与TGF-β1组相比,差异十分显著(P<0.01)。用MTT比色法测定rhBMP-7对CFs增殖的影响,所获结果与细胞计数法一致。(2)细胞经处理48小时后,不同浓度的rhBMP-7组I、III型胶原蛋白产量均有不同程度的下降,并随浓度增加下降更明显,呈浓度依赖性,与TGF-β1组相比,差异十分显著显著(P<0.01)。(3)Real Time-PCR及Western-Blot结果显示,与TGF-β1组相比,rhBMP-7(1-100ng/ml)能浓度依赖性的抑制成纤维细胞Smad2、Smad3、CTGF mRNA和蛋白的表达,差异十分显著(P<0.01)。(4)与rhBMP-7和TGF-β1共处理组相比较,rhBMP-7与Jab-1共处理组的CFs MTT反应OD值,I、III型胶原蛋白含量,Smad2、Smad3、CTGF的mRNA及蛋白表达均明显增加,差异十分显著(P<0.01)。结论:(1)rhBMP-7能浓度依赖性地抑制TGF-β1诱导的CFs细胞的增殖和胶原的合成,抑制CFs细胞的Smad2、Smad3、CTGF mRNA和蛋白表达。(2)rhBMP-7可能通过其下游信号蛋白Smad5来抑制CFs细胞的增殖和胶原的合成。三、rhBMP-7对大鼠心肌梗死后心肌纤维化及左室重构的影响目的:通过腹腔注射rhBMP-7,观察其对心梗后心肌纤维化及左室重构的影响,进一步明确rhBMP-7在体内的抗纤维化作用。方法:对SD大鼠建立急性心肌梗死(AMI)模型,将术后存活的60只大鼠分为以下各组;12只为假手术组(Sham组,开胸后仅在大鼠心脏左冠状动脉处穿线,不结扎冠脉,自术后第2天起,给予腹腔注射生理盐水1ml,隔天一次,共28天);余48只随机分为MI组(n=12,自术后第2天起,给予腹腔注射生理盐水1ml,隔天一次,共28天)、治疗组(n=36分为BMPA、BMPB、Ben三组,每组各12只,自术后第2天起,分别给予rhBMP-7 80ug、320ug每公斤体重隔日一次腹腔注射及贝那普利10mg每公斤体重每日灌胃,用药时间共28天)。每组各取6只分别于术后14、28天处死。HE染色观察大鼠心肌组织损伤的情况;Masson染色观察胶原改变情况,计算左室心肌胶原容积分数(CVF,%)和血管周围胶原面积(PVCA,%);ELISA检测心肌羟脯氨酸(Hyp)、血清I型前胶原羧基端肽(PICP)及III型前胶原氨基端肽(PIIINP)含量;免疫组化检测MMP-9、TIMP-2表达情况;Real Time-PCR和Western-Blot检测BMP-7、TGF-β1、Smad2、Smad3和CTGF mRNA、蛋白的表达情况;超声多普勒评定左室重构和心功能。结果:(1)rhBMP-7能降低大鼠心梗后CVF和PVCA的水平,BMPA组与Ben组无明显差异,BMPB组较BMPA组及Ben组降低得更为明显,有明显差异(P<0.05);(2)rhBMP-7明显减少心肌Hyp、PICP及PIIINP的含量,疗效呈剂量依赖性,BMPA组与Ben组无明显差异,BMPB组优于BMPA组和Ben组,有明显差异(P<0.05)(;3)rhBMP-7明显减少MMP-9的表达,减少MMP-9/TIMP-2的比值,BMPA组与Ben组无明显差异,BMPB组优于BMPA组和Ben组,有明显差异(P<0.05);(4)rhBMP-7可改善左室收缩、舒张功能,逆转左室重构,BMPA组与Ben组之间无明显差异,BMPB组改善程度较BMPA组和贝那普利组更加明显,有明显差异(P<0.05)。结论:(1)腹腔注射rhBMP-7可以减轻心肌纤维化,逆转左室重构;(2)rhBMP-7治疗纤维化的效果呈现一定的剂量依赖性,剂量越大效果越好;(3)320ug/Kg剂量组的rhBMP-7治疗心肌梗死后心肌纤维化的疗效优于贝那普利。