多个物种中的研究表明micro RNA319（miR319）在植物叶片生长发育中发挥重要作用,但对其功能失活突变体的分析及其与花青素合成的关系的研究鲜有报道。CRISPR/Cas9系统作为高效的基因定点编辑工具,在各种物种中得到广泛应用,极大地促进了品种改良和基因功能研究。本论文在确认CRISPR/Cas9系统可以高效地用于矮牵牛基因的定点编辑的基础上,利用CRISPR/Cas9系统分析了miR319及其靶TCPs基因在调控花冠筒条纹形成中的作用。实验结果如下:（1）为了评价CRISPR/Cas9系统在矮牵牛基因组编辑中应用的效果,设计两个靶向Ph PDS外显子的sg RNAs,分别构建于两个CRISPR/Cas9的载体中。转基因植株白化苗统计结果表明:CRISPR/Cas9系统定点编辑矮牵牛PDS基因的效率可以达到58.1%至87.5%。同时,研究发现将Cas9表达载体和靶向PDS的sg RNA表达载体顺次分两次转化导入同一植株的二次转化方法也能实现定点突变,突变效率达到55.6%。研究同时发现,共转化和二次转化Cas9与sg RNA位的方法,都能定点删除PDS片段,删除片段的长度至少可以达到1 kb左右。（2）为了比较两种生成sg RNA方式不同的多基因敲除方法在矮牵牛中的编辑效果,设计三个sg RNAs分别靶向Ph TCP5,Ph TCP6和Ph TCP10,分别构建了常规多基因敲除的载体sg RNA5610（一个启动子转录一个sg RNA）和polycistronic t RNA-g RNA（PTG）多基因敲除载体t RNA-sg RNA5610（一个启动子转录多个sg RNAs）。转基因植株突变检测结果表明:PTG方式的转基因株系只有Ph TCP6基因能发生突变,而Ph TCP5和Ph TCP10都没有突变;常规多基因敲除则表现出现更好的多基因敲除效果,sg RNA5610转基因株系的Ph TCP5,Ph TCP6和Ph TCP10均发生不同类型的突变,其中sg RNA5610-17和sg RNA5610-16株系三个基因的突变属于功能完全失活突变。（3）利用矮牵牛亲本种基因组测序分析得到的miR319成员序列信息,以及NCBI数据库中MD的转录组数据,分析得到6个在MD中表达的miR319a,miR319c,miR319d,miR319e,miR319h和miR319i的前体序列。PCR克隆验证这些基因都存在于MD的基因组。选取miR319c的前体序列构建超表达miR319的植物表达载体,农杆菌转化获得了22株的转基因植株。转基因株系中,miR319成熟体的表达量提高了6至11倍。转基因植株表型观察结果表明:超表达miR319增加叶片面积,减小叶下表皮细胞的投影面积,增加花冠筒长度,促进花冠筒条纹的增加,提高花青素含量。花青素合成相关基因定量结果显示:在超表达miR319植株花冠筒中,花青素结构基因DFR,CHS-A,CHI-A,F3H,F3’5’H,3RT,5GT和GST的表达量都显著提高。以上结果表明:miR319具有促进叶片生长发育和花冠筒条纹形成的功能。（4）为了进一步解析miR319基因成员各自的功能,利用CRISPR/Cas9系统介导miR319成员的突变。通过转基因植物的突变鉴定,获得了miR319a,miR319c和miR319h突变植株。突变体后代分析表明,miR319a和miR319h的突变可以稳定遗传到T1代中;miR319c的突变没有遗传到T1代,而且在T1代中出现新的突变方式。突变体表型观察结果表明:miR319c的突变导致花冠筒缩短;miR319a和miR319h的突变没有引起表型和靶基因表达量的变化。（5）利用矮牵牛亲本种中预测的6个miR319靶基因TCPs序列信息,以及NCBI数据库中MD的转录组数据,从MD中克隆得到这6个基因,并分别命名为Ph TCP5,Ph TCP6,Ph TCP9,Ph TCP10,Ph TCP11和Ph TCP12。其Genbank登录号分别为KC297683,KJ175239,MH711923,MH711924,MH711925,MH711926。进化树分析表明它们都属于CIN-TCP类基因。定量结果显示:在超表达miR319c的植株中只有Ph TCP5,Ph TCP6,Ph TCP9和Ph TCP10的表达量显著下调,Ph TCP11和Ph TCP12的表达量没有下调。以上结果表明:6个预测的靶基因中,miR319可能通过负调控TCP5,TCP6,TCP9和TCP10的表达而发挥功能。（6）为研究miR319靶基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术获得了Ph TCP5,Ph TCP6,Ph TCP9和Ph TCP10的突变体,转基因后代分析表明:这些基因的突变可以稳定遗传到T1代中;四个基因的突变都能促进叶面积的增加,其中phtcp6的叶片变化最为明显;Ph TCP6失活还能明显促进花冠筒的条纹增多,同时伴随着花青素含量的提高;其他靶基因突变并未明显改变花冠筒条纹,但Ph TCP5的突变也能提高花青素含量。与phtcp6突变相比较,花冠筒条纹在phtcp5/6/10三基因突变体中增加更为明显,花青素含量也更多。同时,在超表达Ph TCP6的植株35S:m TCP6中,发现Ph TCP6超量表达抑制了花冠筒条纹的形成,导致花青素含量显著下降。花青素合成的相关基因定量结果显示:在35S:m TCP6植株中,C4H,CHS-A,CHI-A,F3H,F3’5’H,DFR,3RT,5GT,GST和ANS的表达量在花冠筒都显著下调。亚细胞定位和转录活性分析表明:Ph TCP6定位于细胞核具有转录抑制活性。以上结果表明:miR319靶基因具有抑制叶片生长发育和花冠筒条纹形成的功能。（7）植物花色素苷的合成是通过MYB-b HLH-WDR（MBW）蛋白复合体激活花色素苷合成结构基因进行调控的,花色素合成的时空特异性通常是由构成MBW复合体的R2R3-MYB表达的特异性决定的。为了分析miR319-TCP调控花冠筒条纹的机理,首先对花冠筒中表达的两个R2R3-MYB基因DPL和AN4的表达模式与花冠筒脉纹形成的时空关系进行了分析。在MD花冠筒生长发育中,随着条纹的出现,AN4基因表达量逐渐增加,miR319靶基因和DPL基因表达量逐渐降低。在MD花冠筒的两侧,miR319成熟体和AN4在有条纹一侧具有较高的表达量,无条纹区域的表达量低;与此对应,miR319靶TCPs则在无条纹一侧表达量较高,有条纹一侧表达量较低。此外,DPL基因的表达量在超表达miR319植株中显著提高,而在超表达Ph TCP6的植株没有变化;AN4基因的表达量在超表达miR319植株,phtcp6突变体和phtcp5/6/10三基因突变体的花冠筒中都显著上调,在TCP6过表达植株的花冠筒中显著下调。同时,用酵母双杂系统对AN4和DPL与AN1和Ph TCP6之间的相互作用进行分析,结果表明AN4和DPL都能与AN1（b HLH基因）蛋白相互作用,但不能与Ph TCP6蛋白相互作用。以上结果表明:矮牵牛花冠筒条纹形成过程中,AN4基因的表达与条纹的形成呈正相关,而miR319靶TCP基因的表达与之相反;miR319-TCP基因控制花冠筒脉纹形成可能是通过负调控AN4表达量而不是通过与R2R3-MYB蛋白互作实现调控。（8）为了进一步确认AN4和DPL在花冠筒脉纹形成中的作用,利用CRISPR/Cas9技术分别获得了an4和dpl突变体。突变体表型分析表明:DPL失活导致花冠筒远轴面脉络上花青素合成缺失;AN4I失活并未引起花青素合成的任何异常;AN4I和AN4II双基因功能缺失突变导致花冠筒条纹消失,花青素含量降低,花青素合成结构基因F3’5’H,DFR,ANS,3RT,5GT和GST的表达量显著下调。同时通过超量表达AN4发现:AN4具有激活花青素在转基因植株叶片,茎,花萼,花冠筒和花瓣上合成。以上结果表明:AN4控制花冠筒脉纹的形成,DPL控制花冠筒远轴面脉络上花青素的积累。总结以上结果:CRISPR/Cas9系统成功地应用于矮牵牛单基因和多基因敲除、片段删除以及miR319成员的突变。利用CRISPR/Cas9技术揭示了:miR319c具有促进花冠筒伸长的作用;DPL调控花冠筒远轴面脉络上花青素的合成;AN4控制花冠筒内条纹的形成;miR319通过负调控靶基因的表达,增加AN4基因表达,促进花冠筒内条纹的形成。