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研究背景原发性肾病综合征(PNS)是儿童时期的常见病,以微小病变型肾病综合征(MCNS)为主要病理类型,约占80%左右。虽然大部分患儿对肾上腺糖皮质激素治疗效果满意,但是仍有少部分患儿对激素治疗抵抗或频繁复发,甚至可能发展到慢性肾衰或死亡。鉴于此,临床上一直在寻求既能提高激素疗效,又能减轻激素副作用的新药物和新方法。而多年来,中医药在小儿肾脏病(包括肾病综合征)治疗中取得了一定的进展。尽管多年来人们对于中医药治疗儿童原发性肾病综合征进行了多方面的研究,但迄今为止中医药治疗该病的机制仍然不清。近年来,研究者围绕着肾小球滤过屏障的功能障碍,特别是足细胞的损伤,深入探讨了参与蛋白尿发生的多种因素。肾小球滤过屏障的完整性决定着其对蛋白质的选择通透性,。肾小球基底膜中的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)对滤过膜维持电荷屏障起关键作用。乙酰肝素酶(heparanase,HPA)为β-D-内切糖苷酶,可以选择性降解肾小球基底膜HS侧链,在蛋白尿发生机制中发挥着重要作用。同样,nephrin作为足细胞裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)的重要组分参与构成滤过膜机械屏障,既往研究表明其与肾病综合征等多种肾脏疾病蛋白尿的发生密切相关。益气养阴方是近年来我院临床常用于辅助治疗儿童肾病的协定处方,取得了一定的效果。本研究拟以微小病变型肾病综合征的动物模型为对象,在蛋白和基因水平观察研究大鼠肾组织中HPA和nephrin的表达和变化,探讨益气养阴方对阿霉素肾病大鼠的肾小球滤过屏障的影响及其机制研究。第一部分益气养阴方对阿霉素肾病大鼠的影响目的观察益气养阴方对阿霉素肾病模型大鼠24h尿蛋白排泄量、各项生化指标以及肾脏病理的变化,以研究益气养阴方对阿霉素肾病模型的影响。方法(1)阿霉素肾病大鼠动物模型的建立。雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,共30只,随机分为5组,每组6只,分为正常对照组、模型组和干预组益气养阴方组、干预组激素组和干预组益气养阴+激素组。体重110-130g。实验组给予一次性尾静脉注射盐酸阿霉素5mg/kg;对照组给予尾静脉注射等量生理盐水。在阿霉素注射后7天、14天、21天及28天分别收集24小时尿,第28天处死实验组和对照组大鼠。(2)常规生化方法测定大鼠24小时尿蛋白定量及血脂、肾功能等生化指标;光镜和电镜下观察大鼠肾脏病理改变。(3)应用SPSS13.0统计软件进行分析,所有计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。组间比较采用One-Way ANOVA进行单因素方差分析,组间比较采用LSD检验。结果(1)微小病变型肾病综合征动物模型的建立:在注射阿霉素后第14天出现大量蛋白尿(330.4±198.6,P<0.01),血清白蛋白明显减少(9.55±3.90,<0.01),总胆固醇(1.63±0.44,P<0.01)和甘油三酯(1.35±0.11,P<0.05)明显增高,以上各项指标均在第28天达高峰。肾组织电镜观察显示实验组大鼠于阿霉素注射后28天足突广泛融合。(2)模型组与各干预组的比较:益气养阴方组、激素组和益气养阴方+激素组干预28天后,蛋白尿排泄量下降,血清白蛋白升高,胆固醇和甘油三酯降低,尤以益气养阴方+激素组干预组最为明显。(3)组织形态学研究:肾组织电镜观察显示,各干预组阿霉素注射后28天肾小球足细胞足突部分融合较模型组均有轻,尤以益气养阴方+激素组最为明显,未见明显足突融合。小结益气养阴方可能通过减轻模型大鼠肾小球足细胞足突损伤,减少阿霉素肾病大鼠尿蛋白的排泄,尤以益气养阴+激素组保护效果更为显著。第二部分益气养阴方对大鼠肾脏乙酰肝素酶和足细胞nephrin蛋白的影响目的分别研究各组阿霉素肾病大鼠肾组织HPAmRNA和尿中HPA浓度的表达,以及肾组织nephrin mRNA和nephrin蛋白表达变化,以探讨益气养阴方对大鼠肾脏基底膜及其足细胞相关分子的影响。方法(1)研究对象采用在第一部分建立的微小病变型肾病综合征动物模型(阿霉素肾病大鼠),分组情况和取材时间同第一部分。(2)采用实时荧光定量PCR方法,检测各组28天后肾组织HPAmRNA的表达;采用酶联免疫吸附法(ELISA),检测各组鼠尿中HPA浓度。采用免疫组织化学染色,半定量和定位检测nephrin蛋白的表达;免疫组化图像分析采用Motie image3.2图像分析软件进行分析。(3)应用SPSS13.0统计软件进行分析,所有计量数据以均数±标准差((?)±s)表示。组间比较采用One-Way ANOVA进行单因素方差分析,组间比较采用LSD检验。用Pearson法分析HPA变化与蛋白尿的相关性。结果(1)实验28天后,模型组大鼠肾组织HPAmRNA表达(4.55±0.38),明显高于正常对照组肾组织HPAmRNA表达(1.50±0.79),两组有显著统计学意义(P<0.001);而其他各组中,益气养阴方组(3.56±0.18)和益气养阴+激素组(3.13±0.81)较模型组HPAmRNA表达量少,有统计学意义(P<0.05),其中,尤以益气养阴+激素组减少量最显著(3.13±0.81)。并且HPA在肾脏中的表达量与24h尿蛋白量呈显著正相关(r=0.708,P<0.005)。(2)实验28天后,模型组大鼠尿中HPA浓度要高于正常组,有统计学意义(P<0.05);而其他3组干预组,尿中HPA浓度均低于模型组,高于正常组,但无统计学差异。(3)肾组织nephrin mRNA水平的表达:与正常对照组(0.93±0.07)相比,模型组肾脏nephrin mRNA(1.04±0.11)表达升高,有统计学差异(P<0.05)。而益气养阴方组、激素组和益气养阴方+激素组的表达都不同程度的下降,分别为(0.96±0.11、0.92±0.02和0.91±0.01)接近正常组表达,尤以激素组、益气养阴+激素组下降明显,有统计学意义(P<0.05)。(4)各组大鼠肾组织nephrin平均面密度比(即nephrin蛋白阳性表达面积与视野总面积百分比)表达结果正好相反。与正常对照组(23.77±4.50)相比,模型组肾脏nephrin平均面密度比明显下降(15.1±1.42,P<0.05),有统计学差异。而其他干预后各组nephrin平均面密度比,与模型组比较均有升高(分别为16.96±1.00、18.49±1.60和19.90±3.30);除益气养阴+激素组升高有统计学意义(P<0.05),其他两组没有统计学差异。(5)各组大鼠肾小球nephrin蛋白平均面密度比与大鼠24h尿蛋白之间呈负相关(r=-0.66,P<0.05)。小结(1)结果显示益气养阴方组、激素组、益气养阴+激素组均能影响肾脏HPA表达,表明益气养阴方可能通过降低肾脏HPA表达,以保护肾小球滤过屏障中GBM的完整性,从而实现降低蛋白尿。(2)同时结果也显示,Nephrin的变化和蛋白尿发生存在着密切关系;同时,益气养阴方组、激素组、益气养阴+激素组均能影响肾脏nephrin表达,并且以益气养阴+激素组最为显著;这表明益气养阴方降低蛋白尿的机制之一,可能与调节肾脏nephrin的表达有关。结论1.益气养阴方可以通过减轻模型大鼠肾小球足细胞足突损伤,减少阿霉素肾病大鼠尿蛋白排泄,以益气养阴+激素组保护效果更为显著。2.益气养阴方可能通过抑制肾脏HPA,从而保护GBM完整性,维持了滤过膜电荷和机械屏障,最终使蛋白尿减低。3.益气养阴方组可能通过调节足细胞SD中的nephrin蛋白表达,来维持保护肾小球滤过屏障,以降低蛋白尿的发生发展。并且研究显示以激素合用益气养阴方效果比益气养阴方和激素单用更为显著;这也为临床上使用两者联合应用治疗NS提供了理论依据。