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新孢子虫病是由犬新孢子虫引起牛和其它动物的重要的原虫病,该病可引起牛的流产、死胎及神经系统障碍疾病,已给养牛业造成了严重的经济损失。对新孢子虫病的防控目前尚无有效的方法。目前,以病毒为载体的疫苗得到了广泛研究,其中腺病毒载体疫苗在寄生虫领域也得到了应用且卓见成效,而以DNA疫苗初免、病毒载体疫苗加强免疫的策略在诱导接种动物体液免疫和细胞免疫方面显示了良好的效果。本试验根据GenBank中(AB265823.1)已公布的犬新孢子虫AMA1基因序列,设计并合成扩增AMA1基因的两对特异性引物,应用RT-PCR方法对牛源犬新孢子虫吉林株AMA1基因进行扩增,将扩增的AMA1基因克隆至pMD18-T simple载体,将测序正确的AMA1基因分别亚克隆至pVAX-1真核表达载体与pCR259腺病毒穿梭载体。将构建的pVAX1-AMA1真核表达质粒转入Vero细胞进行表达,并通过间接免疫荧光和western blot检测其表达产物,之后通过质粒中提试剂盒大提pVAX1-AMA1质粒,制备核酸疫苗。同时将构建的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMAl依次转化HighQ-1Transpose-AdTM294和HighQ-1TM感受态细胞,构建并纯化犬新孢子虫AMA1基因重组腺病毒表达质粒294-AMA1。通过脂质体将线性化的294-AMA1质粒转染至QBI-HEK293细胞以包装Ad5-NcAMA1重组腺病毒。通过IFAT和Western blot检测犬新孢子虫AMA1基因在QBI-HEK293细胞中的表达。获得的Ad5-NcAMA1病毒滴度为5.62×109/mL,大量扩增、纯化后制备重组腺病毒载体疫苗。应用制备的核酸疫苗和腺病毒疫苗,按照Prime-Boost免疫组、Ad5-NcAMA1重组腺病毒免疫组、pVAX1-AMA1核酸疫苗组及PBS对照组对BALB/c小鼠进行免疫接种。通过间接ELISA测定小鼠IgG、IgG1及IgG2a抗体水平；通过ELISA试剂盒检测IFN-y与IL-4细胞因子水平；通过流式细胞仪检测小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群变化。结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫吉林株AMA1基因大小为1695bp,与GenBank中AMA1基因(AB265823.1)核苷酸同源性为99.9%,氨基酸同源性为99.8%。构建的pVAX1-AMA1真核表达质粒及重组腺病毒质粒均可在真核细胞内表达,表达蛋白分子量约为68kDa。BALB/c小鼠接种分析表明,Prime-Boost免疫组IgG抗体水平均极显著高于pVAX1-AMA1核酸疫苗组(P<0.01)与Ad5-NcAMA1免疫组(P<0.01); Prime-Boost免疫组IgGl水平显著高于Ad5-NcAMA1免疫组(P<0.05)与pVAX1-AMA1核酸疫苗组(P<0.05); Prime-Boost免疫组IgG2a抗体水平显著高于pVAX1-AMA1核酸疫苗组(P<0.05),与Ad5-NcAMA1免疫组差异不显著。Prime-Boost免疫组IL-4水平显著高于病毒免疫组Ad5-NcAMA1(p<0.05),极显著高于pVAX1-AMA1免疫组(P<0.01)；Prime-Boost免疫组IFN-γ水平显著高于pVAX1-AMA1核酸疫苗组(P<0.05),与病毒免疫组Ad5-NcAMA1差异不显著。CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群分析表明,Prime-Boost免疫组CD4+均显著高于Ad5-NcAMA1免疫组(P<0.05)与pVAX1-AMA1核酸疫苗组(P<0.05); CD4+/CD8+T极显著高于pVAX1-AMA1核酸疫苗组(P<0.01)、显著高于Ad5-NcAMA1免疫组(P<0.05); Prime-Boost免疫组CD8+显著高于PBS对照组(P<0.05)。Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcAMA1免疫组及pVAX1-AMA1核酸疫苗组相比,在一定程度上增强了小鼠的体液免疫与细胞免疫水平,本试验为新孢子虫病新型疫苗及免疫策略研究奠定了基础。