背景:阿片类药物是处方量最大和最有效的镇痛药,吗啡和其他阿片类药物的治疗作用受限于其副作用:包括恶心、呕吐、腹痛和便秘,统称为阿片类药物引起的肠功能障碍。目前研究表明胃肠道Cajal间质细胞（Interstitial cells of Cajal,ICCs）是胃肠道的起搏细胞,其分化、成熟对胃肠道功能有着重要的作用;而阿片类药物引起的肠功能障碍与胃肠道ICCs细胞之间是否相关及其具体的作用机制仍不明确,作者此前的研究表明吗啡或联合小剂量纳洛酮硬膜外输注兔的近端结肠ICCs数量减少、形态遭到破坏、c-kitmRNA及蛋白表达明显降低,而小剂量纳洛酮可以逆转以上表现;其对ICCs电生理方面的研究目前未见其他学者研究。本研究（基础研究）通过吗啡或联合小剂量纳洛酮对兔肠道ICCs细胞电生理的影响及（临床研究）吗啡或联合小剂量纳洛酮对下肢骨折患者术后镇痛观察其对胃肠道功能的影响相结合的方法来探讨吗啡硬膜外输注对胃肠功能作用的可能机制。目的:本研究旨在探讨以下问题:1,兔肠道ICCs细胞的体外培养及鉴定;2,吗啡或联合小剂量纳洛酮对兔肠道ICCs细胞的电生理的影响及其可能的作用机制;3,为排除胃肠道等腹部手术对观察指标的影响,选用择期下肢骨科手术采用硬膜外输注吗啡或复合小剂量纳洛酮镇痛的方法,采用患者主观问卷调查表和MRI客观检测相结合的方法观察其对胃肠功能的影响及探讨其对胃肠道功能的影响;4,对以上相关的探索及阐述为围术期术后镇痛及临床疼痛治疗防治阿片类药物副作用提供更好策略以及进一步研究阿片类药物对胃肠道功能及其ICC细胞的影响机制提供重要的参考信息。方法:第一部分:家兔随机分为吗啡组（M组）、吗啡复合小剂量纳洛酮组（MN组）、生理盐水组（NS组）共3组,每组6只。硬膜外穿刺成功置管1天后,接CBI硬膜外镇痛泵,连续输注5天。进行如下研究:1,ICC的体外培养:停止给药后1d,经耳缘静脉注入空气20ml处死,立即开腹,取盲肠下方至直肠的结肠组织,用K-B液冲、漂洗肠组织,固定于培养皿的底部,然后置于装有无钙Hank’s溶液的培养皿中,用常规方法在解剖显微镜下剥离黏膜层并切成小碎片,用Ⅱ型胶原酶分离细胞,分离后的细胞接种SMGM培养液内并放入培养箱中进行培养,培养1d后更换为单纯含有SCF因子的SMGM培养液培养。2,ICC的免疫学鉴定:细胞培养稳定72h后进行免疫荧光学鉴定,倒去培养皿中培养液,滴加1∶200稀释的SA1022-兔IgG抗体（武汉博士德生物工程有限公司）,37℃孵育过夜,PBS冲洗2min×3次,滴加1∶200稀释的生物素化山羊抗兔IgG抗体（武汉博士德生物工程有限公司）,PBS冲洗,DAB显色,苏木精轻度复染,中性树胶封片。细胞染色呈棕色者为阳性细胞。3,ICC的激光共聚焦荧光标记及显微镜观察:实验当天以培养基溶液稀释至终浓度为4μmol/L的工作液（避光）。取出培养72小时的培养皿,移除培养基,以上述配置液冲、漂洗2次,加入5μM的fluo-4AM放置于5%C0₂培养箱内37℃孵育5分钟,取出后再冲洗两次,室温下静放10分钟,使细胞温度与室温相同,恢复细胞稳定性。将培养皿置于激光共聚焦显微镜载物台上,选择镜下细胞染色良好的视野,每个培养皿随机选20个细胞扫描记录成像,META自带分析软件测量获得每个细胞长度值。从中随机选10个ICC样细胞200ms/张图片速度进行扫描,ICC样细胞内相对荧光强度代表钙离子的浓度,获得每个时间点细胞内钙离子荧光强度值。4,取出培养72小时的ICC细胞,室温下使用不含有钙的生理盐水反复冲洗3次,取盖玻片倒置于显微镜镜台上的灌流槽底部进行灌流（1³ml/min）,其灌流温度设置在30³2℃之间,用电阻在2⁵MΩ全细胞传统钳制模式的玻璃电极进行1¹0MΩ的封接,膜电位钳制在-60mV,电流通过EPC-10膜片钳放大器记录分析处理。第二部分:应用随机双盲研究设计,纳入30例择期行下肢骨折内固定手术的患者,所有患者均采用椎管内硬膜外麻醉。随机化结果被隐藏在不透明的信封中,术后镇痛随机分为3组:罗哌卡因组（L组）、罗哌卡因+吗啡组（LM组）、罗哌卡因+吗啡+纳洛酮组（LMN组）,连续术后镇痛5天。性别不限,年龄20⁶0岁,ASAⅠ-Ⅱ级,预期住院时间至少7天。记录术中手血压、心率、手术持续时间、失血量和术中补液量。记录术后在静息（VAS休息）和活动（VAS动态）时的术后第1、3和5天VAS评分。监测患者有无恶心、呕吐、瘙痒、镇静、运动或感觉阻滞、低血压、心动过缓和呼吸抑制等副作用。收取患者每天自主胃肠功能问卷调查调查表（BFI、GSRS、PAC-SYM、BSFS）并作相应分析;术后镇痛1天和5天的肠道MRI检查并分析结果。结果:第一部分:1,体外培养ICCs细胞是可行的;生理盐水组与吗啡复合小剂量纳洛酮组体外培养的ICC细胞C-kit蛋白呈阳性表达,突起和胞体着色明显,其表达的细胞具有ICC细胞特有的形态特征:胞体呈梭形或三角形,胞核大、胞浆少,与邻近的细胞突起及胞体互相连接成网络状;而吗啡组ICC细胞C-kit蛋白呈表达明显较少,形态遭到很大程度的破坏,数量明显减少;2,生理盐水组与吗啡复合小剂量纳洛酮组ICC细胞内钙离子荧光值无明显变化,而吗啡组ICC细胞内钙离子荧光值较生理盐水组及吗啡复合小剂量纳洛酮组明显降低（P<0.05）;生理盐水组与吗啡复合小剂量纳洛酮组ICC样细胞长度无明显变化,而吗啡组ICC样细胞细胞长度较生理盐水组及吗啡复合小剂量纳洛酮组明显缩短（P<0.05）;3,在生理盐水组与吗啡复合小剂量纳洛酮组中单个ICC的起搏电流振幅分别为:（19.85±3.75）pA、（19.53±3.81）pA,而吗啡组中单个ICC起搏电流振幅为（6.56±4.22）pA;与生理盐水组、吗啡复合小剂量纳洛酮组比较,吗啡组的钳制电流明显降低（P<0.05）;而生理盐水组与吗啡复合小剂量纳洛酮比较,两组基本上没有变化（P>0.05）。生理盐水组与吗啡复合小剂量纳洛酮ICC的起搏频率分布为（22.5±2.15）次/min、（21.5±2.92）次/min,而吗啡组ICC的起搏频率为（10.25±2.35）次/min,;与生理盐水组、吗啡复合小剂量纳洛酮组比较,吗啡组的ICC起搏频率明显降低（P<0.05）;而生理盐水组与吗啡复合小剂量纳洛酮比较,两组基本上没有变化（P>0.05）。第二部分:1,三组患者的年龄、性别、BMI、ASA分级差异无统计学意义,三组患者麻醉时间和手术时间、输液量、失血量和尿量比较差异无统计学意义,术后镇痛罗哌卡因L组较LM组、LMN组用量增多,差异有统计学意义（p<0.05）,吗啡给药的总量在3组之间无明显差异,差异无统计学意义（P>0.05）;2,在整个术后期间,所有人患者有足够的镇痛效果,三组组间静息时VAS疼痛评分第1天至第5天无明显差异（P>0.05）,L组与LM组在活动时第1、3、5天时,VAS评分无差异（P>0.05）,LMN组在活动时（第1、3、5天）的VAS评分较L组与LM组明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）;3,三组均未见镇静、运动或感觉阻滞、低血压、心动过缓和呼吸抑制等副作用。L组、LMN组未发现有恶心、呕吐、皮肤瘙痒;LM组在治疗期间发生呕吐2例（20%）、恶心4例（40%）、皮肤瘙痒4例（40%）,较L组、LMN组明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;4,L组经基线校正的BFI症状总分评分（第一天和第五条比较）较L组和LMN组明显增加,差异有统计学意义（P<0.001）;经基线校正的BFI症状评分L组和LMN组比较无明显变化（P>0.05）;三组GSRS总评分（第一天和第五天总分的平均分）比较,LM组与L组和LMN组比较,总分差有统计学意义,（F=29.72;P<0.001）、维度之间总体差异有统计学意义,（F=15.54;P<0.001）;以及总分和维度之间的差异有统计学意义,（F=12.48;P<0.001）;罗哌卡因组和罗哌卡因+吗啡+纳洛酮组比较,无明显变化。罗哌卡因+吗啡组与罗哌卡因组和罗哌卡因+吗啡+纳洛酮组比较,在便秘方面之间差异有统计学意义（P<0.001）,罗哌卡因组和罗哌卡因+吗啡+纳洛酮组之间比较无明显差异（P>0.05）;便秘症状问卷的患者评估（PAC-SYM）LM组与L组、LMN组比较,明显升高,差异有统计学意义（F=24.42;P<0.001）;LM组PAC-SYM评分在术后治疗与治疗日之间的相互作用差异有统计学意义（F=3.87;P=0.01）,在治疗的第4天（P<0.001）和第5天（P<0.001）与第一天存在显著差异。此外,在LM组治疗期间PAC-SYM评分,在第2天和第4天之间（第2天较基线下降2%,第4天较基线增加176%;P=0.002）以及第2天和第5天之间（第2天较基线下降2%,第5天较基线增加198%,P<0.001）检测到显著差异。在L组、LMN组PAC-SYM评分中,未检测到不同天之间基线校正值的差异（P>0.05）;LM组与L组、LMN组排便频次的比较,排便频次明显降低,差异有统计学意义（F=7.87;P=0.005）;LM组治疗与治疗日期排便频次的比较,差异有统计学意义（F=8.11;P<0.001）;数据分析显示排便频次LM组与L组、LMN组比较,第2天排便减少87次,差异有统计学意义（排便减少87次,P<0.001）。LM组与L组、LMN组粪便形状评分的比较,差异有统计学意义（F=56.34,P<0.001）;数据分析显示,与L组、LMN组比较,LM组治疗期间所有天数的粪便形态评分均显著降低（第1天至5天评分分别降低37%、52%、64%、40%、73%,P<0.005）;5,LM组与L组、LMN组比较（第一天和第五天MRI扫描结果）,肠道气体容积总体积气明显增多,差异有统计学意义（F=9.68,P=0.002）,在盲肠/升结肠、横结肠的积气也是明显增加,差异有统计学意义（F=4.89,P<0.001）;在LM组治疗期间,从第一天至第五天,盲肠/升结肠体积明显加（41%,P=0.005）,横结肠明显增加（20%,P=0.005）,总结肠也是增加（16%,P=0.008）,差异有统计学意义。在L组、LMN组仅在第一天盲肠/升结肠体积明显加（14%、13%,P=0.03）,其他部位及治疗天数之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1,体外培养ICCs细胞的可靠性确切。2,NS组、MN组体外培养的ICC细胞具有其特有的形态特征:胞体呈梭形或三角形,胞核大、胞浆少,与邻近的细胞突起及胞体互相连接成网络状;而M组ICC细胞形态遭到很大程度的破坏,数量明显减少;NS组、MN组ICC细胞内钙离子荧光值无明显变化,而M组ICC细胞内钙离子荧光值较NS组、MN组明显降低;NS组、MN组ICC样细胞长度无明显变化,而M组ICC样细胞长度较NS组、MN组明显缩短;M组单个ICC的起搏电流振幅与NS组、MN组比较明显降低;M组起搏电流频率与NS组、MN组比较明显降低,而NS组起搏电流振幅及频率与MN组比较基本没有变化。3,硬膜外输注吗啡使兔近端结肠组织ICC的表达造成障碍、ICCs样细胞钙离子电流减弱、ICCs样细胞的起搏电流降低,可能导致近端结肠ICCs样细胞起搏功能的障碍/减弱和细胞信号/信息传输出现一定的障碍,进而发生阿片类药物引起的肠功能障碍综合征;NS组与MN组基本上无变化,联合应用小剂量纳洛酮后能够逆转吗啡对ICCs样细胞造成的以上影响。4,据此我们推测吗啡可能是通过作用在兔肠道ICCs起搏细胞上的阿片受体作用对ICCs形态表达、起搏电流及信号传输等阻滞或障碍进而导致肠功能障碍。5,L组、LM组及LMN组对患者术后镇痛效果良好,LMN组在第1、3、5天的活动后镇痛效果更佳,同时降低了吗啡的不良反应;6,通过MRI对患者肠道容积的客观测量,来评估吗啡对肠功能的影响的检测是可行的;7,LMN组增强镇痛效果的同时,其胃肠道的BFI、GSRS、PAC-SYM、BSFS的评分及MRI检测肠道容积均较均LM组有临床意义,同时降低了局麻药的用量。通过两部分的研究,我们推测其可能的机制是吗啡主要通过作用与胃肠道的起搏细胞ICCs表达的阿片受体上,通过对ICCs细胞表达的阻碍、起搏电流的阻滞、信号/信息传输的阻碍进而导致肠功能障碍;应用阿片受体拮抗剂纳洛酮可以逆转吗啡的以上作用。为围术期术后镇痛及临床疼痛治疗防治阿片类药物副作用提供更好策略以及进一步研究阿片类药物对胃肠道功能及其ICC细胞的影响机制提供重要的参考信息。