随着人口老龄化和生活方式改变,2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)发病率逐年升高,其中25%～40%的患者可并发糖尿病肾病(DiabeticNephropathy,DN)。中华肾脏病协会的最新数据显示,DN已成为我国终末期肾病(End Stage Renal disease,ESRD)的第二位原因,而在欧美等发达国家,早已是首位原因。DN是糖尿病最严重的微血管并发症之一,为糖尿病患者的主要死因,患者一旦发生肾脏损害、出现持续蛋白尿,则病情不可逆转,进行性发展直至ESRD。长期以来,肾脏病学者一直致力于DN的发病机制研究,越来越多的事实表明,脂代谢紊乱在DN的发生发展过程中起重要作用。早在1936年Kimmelstiel和wilson便在DN患者的肾小动脉、肾小球和肾小管内发现大量的脂质沉积。动物实验证实,高胆固醇血症可致肾小球局灶硬化,而降脂治疗后肾小球损伤减轻。临床研究也发现,脂代谢紊乱是2型糖尿病肾病的独立危险因素。脂代谢紊乱与DN的发生发展关系密切,在DN发病中的作用日益受到重视。然而,脂类物质在加重2型糖尿病肾病损伤方面的具体作用及机制目前尚不清楚。为此,我们选用以脂代谢紊乱为特征的2型糖尿病肾病动物模型——KK-Ay小鼠,采用液相色谱质谱串联(LC/MS)为基础的代谢组学技术,对小鼠血清中的脂代谢产物进行分析,寻找对糖尿病肾病发病贡献率大且有临床研究价值的代谢产物,并进一步研究它们在糖尿病肾病发病中的作用机制。本实验由两部分组成。一、糖尿病肾病小鼠脂代谢紊乱的代谢组学研究初步探讨LC/MS为基础联合主成分分析(PCA)的代谢组学技术,在KK-Ay小鼠2型糖尿病肾病早期诊断、生物标记物发现以及脂代谢紊乱机制研究中的作用和意义。选取雄性6周龄KK-Ay小鼠和具有相同遗传背景的C57BL/6J小鼠,分别于8、12、14、16、18、20周龄收集血、尿标本。血清用于检测葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、尿素氮、肌酐、白蛋白,由自动生化分析仪完成。24小时尿液和随意尿用于尿微量白蛋白的检测,由手工操作ELISA试剂盒完成。8、12、20周龄每组各处死3只小鼠行肾脏病理检查。8、12、14、16、20周龄小鼠血清行代谢组学检测,样品经乙腈除蛋白后,加至质谱仪,经气化、离子化、加速分离及检测分析后得到代谢组图谱,再用XCMS工具包进行原始数据导出、谱峰匹配、CVS数据生成等预处理,最后经MATLAB 7.0自编软件对预处理数据进行多元统计分析,得到得分矩阵图(score plot)和权重矩阵图(loading plot),并在权威数据库中检索,合理解释结果。根据生化及病理检查我们将KK-Ay小鼠DN病程分为3期:8周龄～11周龄为糖尿病非肾病期,12周龄～19周龄为早期糖尿病肾病期,20周龄及以后为典型糖尿病肾病期。并以此分期作为代谢组学技术诊断准确性的衡量标准。结果发现,得分矩阵图(score plot)能够将各周龄模型组和对照组小鼠区分开来,糖尿病非肾病期聚类效果稍差,早期DN期开始聚类效果逐渐理想。通过对8、12、20周龄三个时间点权重矩阵图(loading plot)的分析发现,油酰甘油磷酸胆碱、硬脂酰甘油基磷酸胆碱、软脂酰溶血卵磷脂等代谢产物在模型组显著升高(P＜0.05),且对2型糖尿病肾病贡献较大,这些代谢产物初步认为可以作为病程中的生物标志物而做进一步的研究证实。通过对KEGG等数据库查询,认为KK-Ay模型中以溶血卵磷脂和磷酸胆碱为主的脂代谢紊乱可能与磷酸胆碱转移酶、磷脂酶等的调节异常有关。二、高浓度油酸对系膜细胞增殖、纤维化和炎症的影响20周龄权重矩阵图提示油酸对DN发病的贡献较大,且油酸的相对谱峰面积在DN模型组高于对照组(P＜0.05),因此本部分实验通过体外研究进一步探讨油酸对系膜细胞增殖、纤维化和炎症的影响及机制。细胞外基质生成和降解失衡是肾小球纤维化的基础,TIMP-1能够抑制细胞外基质降解,我们通过半定量RT-PCR观察到不同浓度油酸作用24小时后,TIMP-1mRNA的量随油酸浓度的增加而升高。TGF-β是公认的肾纤维化指标,FN是构成细胞外基质的主要物质,两者在肾小球纤维化中起重要作用。通过免疫细胞化学对TGF-β进行半定量分析,并用ELISA法检测细胞培养液上清中TGF-β和FIN分泌量。结果显示,TGF-β主要在MC胞浆内表达,同样作用24小时,油酸浓度越高胞浆黄染越深,TGF-β表达越多。TGF-β是一种分泌性蛋白,油酸浓度越高、对体外培养MC作用时间越长,细胞上清液中TGF-β分泌越多,FN呈现同样趋势。以上结果从蛋白水平说明油酸可使TGF-β表达增多,而TGF-β可能是通过刺激MC合成FN等系膜基质促进肾小球纤维化。我们还通过MTT实验观察到高浓度油酸能够使MC增殖,但促增殖作用随油酸浓度增加和作用时间延长增强并不显著,这可能由于TGF-β表达增多影响细胞周期抑制细胞增殖有关。此外,炎症机制是DN持续发展的关键因素,我们用EMSA法检测不同浓度油酸刺激24小时后NF-κB活性变化,半定量RT-PCR检测其协同因子UXT及下游因子MCP-1转录量的变化。结果显示,随着油酸浓度的增高,以上各指标的半定量都呈上升趋势,说明油酸是MC炎症反应的刺激因子之一,可能在糖尿病肾病的发生发展中起一定作用。本部分实验结果表明,油酸对MC的各种作用不是由于FFA-BSA造成的,而是通过其本身所致,FFA-BSA只起到载体的作用。油酸是肾小球硬化和炎症的诱导因素之一,在脂毒性肾脏病中发挥重要作用,也为临床使用降脂药物治疗慢性肾小球疾病提供了进一步理论依据。总之,通过以上两部分的实验研究,我们认为代谢组学技术在2型糖尿病肾病早期诊断、生物标记物发现、脂代谢紊乱机制等方面的研究有较大的提示作用和意义。代谢组学分析结果显示在KK-Ay小鼠的典型DN期,油酸对DN贡献率大,通过油酸对系膜细胞影响的体外实验研究证实,油酸能够刺激系膜细增殖、促进炎症和纤维化,在肾小球硬化中起重要作用。