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研究目的miR-146a是炎性免疫反应的重要调节因子之一,其两个主要靶基因IL-1相关蛋白激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1, IRAK1)和肿瘤坏死因子受体活化因子6(TNF receptor-associated factor 6, TRAF6)是Toll样受体4(toll like receptor 4, TLR4)信号转导通路中重要衔接因子,而TLR4信号转导通路的活化与神经病理性疼痛密切相关。本课题拟检测双侧坐骨神经慢性压迫损伤(bilateral chronic constriction injury, bCCI)大鼠L4-6背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)中 microRNA-146a的表达变化及TLR4信号转导通路活化情况,研究其对IRAK1和TRAF6参与疼痛相关TLR4信号转导通路的调节作用,并探讨干预miR-146a表达后对bCCl神经病理性疼痛大鼠疼痛行为的影响,从而明确miR-146a对神经病理性疼痛的调控机制。研究方法1.检测bCCI神经病理性疼痛大鼠DRG中miR-146a表达及TLR4信号转导通路活化情况雌性SD大鼠,体重200-250g,采用随机数字表法随机分为①正常对照组(Naive) (N=12);②假手术组(Sham) (N=12):进行大鼠双侧假手术,仅暴露双侧坐骨神经不结扎；③双侧坐骨神经压迫损伤组(bCCI组)(N=12)：建立大鼠bCCI模型。在建模前1天、后1、3、7、14及21天监测3组大鼠机械刺激诱发痛、热刺激诱发痛行为学指标。实时定量PCR法检测大鼠L4-6 DRG中TLR4和miR-146a及其靶基因IRAK1、TRAF6 的mRNA表达水平；Western-blot法检测TLR4信号转导通路中TLR4、MyD88、TRIF、IRAK1、TRAF6、NF-κB及p-NF-κB蛋白表达水平变化；免疫组化对TLR4、IRAK1 和 TRAF6定位检测。ELISA检测不同时间点三组大鼠DRG中IL-6和TNF-a的表达水平。2.干预miR-146a表达对bCCI神经病理性疼痛大鼠疼痛行为学影响及其分子机制雌性SD大鼠,体重200-250g,采用随机数字表法随机分为①miR-146a过表达处理组(agomir-146a) (n=6); ②miR-146a低表达处理组(antagomir-146a)(n=6)；⑧阴性对照组(negative control, NC) (n=12)。各组均行双侧坐骨神经慢性压迫手术,于手术当天及术后第3、5、7、10天分别经鞘内注射容量为10 μ1的 agomiR-146a或 antagomiR-146a及相应对照试剂(5nmol溶于生理盐水),于术前及术后第1、3、7、14天进行动物行为学评估,观察大鼠对机械和热刺激的反应。实时定量PCR法检测术后第14天大鼠L4-6 DRG miR-146a及IRAK1、TRAF6的mRNA表达水平；Western-blot法检测IRAK1、TRAF6蛋白表达水平变化。培养DRG神经元原代细胞,分别孵育agomiR-146a、antagomiR-146a及对照试剂24小时后利用钙成像技术观察各组细胞LPS刺激后细胞内钙离子内流情况。结果1.与Naive组及Sham组相比,bCCI组大鼠L4-6 DRG中miR-146a在建模后第3天降低,第7天达最低值,第21天恢复基线水平。IRAK1和TRAF6的mRNA和蛋白水平均明显升高,且3组在不同时间点具有统计学差异(P<0.05)。免疫组化证实IRAK1和TRAF6均在DRG神经元细胞上表达,且IRAK1以在肽能神经元上表达为主(52.3%),而TRAF6则较多表达在非肽能神经元上(63%)。2.与Naive组及Sham组相比,bCCI组大鼠L4-6 DRG中TLR4 mRNA水平显著升高,三组在不同时间点具有统计学差异(P<0.05)。TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平升高(P<0.05),TRIF蛋白水平无明显改变(P>0.05)。免疫组化证实TLR4在DRG神经元细胞上表达；ELISA结果提示相比Naive组及Sham组,bCCI组大鼠DRG中IL-6和TNF-α表达水平增加(P<0.05)3.与NC组相比,agomiR-146a组bCCI大鼠机械刺激阈值和热辐射刺激阈值均升高,各组不同时间点差异具体统计学意义(P<0.05)。agomiR-146a组bCCI大鼠L4-6 DRG中miR-146a表达量显著上调,IRAK1和TRAF6 mRNA和蛋白水平均显著下降(P<0.05)。与NC组相比,antagomiR-146a组bCCI大鼠疼痛行为学机械刺激和热刺激阈值无统计学差异。antagomiR-146a组bCCI大鼠L4-6DRG中miR-146a表达下调,IRAK1和TRAF6 mRNA和蛋白水平均显著增加(P<0.05)。原代DRG神经元细胞钙成像结果显示agomiR-146a可有效减少细胞内钙离子内流阳性率(1.59%),而antagomiR-146a组细胞内钙离子增加(12.5%)。结论1.背根神经节中niR-146a表达下调,作用其靶基因IRAK1和TRAF6参与bCCI大鼠神经病理性疼痛。2.bCCI神经病理性疼痛大鼠背根神经节中TLR4-MyD88-NF-κB信号转导通路活化。3.鞘内注射agomiR-146a上调miR-146a表达水平可有效缓解bCCI神经病理性疼痛大鼠疼痛行为学。