【摘 要】
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趋化因子是一类具有趋化特性的细胞因子,具有使细胞分化、迁移和运输等功能,其中CC样趋化因子19（CCL19）具有调控免疫细胞迁移,募集机体成熟的树突状细胞和T细胞,延长细胞存活和抗细胞凋亡的作用。本团队前期研究表明,IBDV感染后,CCL19表达水平显著上升,参与T细胞迁移浸润法氏囊的过程。IBDV VP2基因编码病原的主要结构抗原蛋白VP2,是研究IBD DNA疫苗的主要免疫原基因。因此,本研究
【基金项目】
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河南省高等学校重点科研项目（21A230003）；
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趋化因子是一类具有趋化特性的细胞因子,具有使细胞分化、迁移和运输等功能,其中CC样趋化因子19（CCL19）具有调控免疫细胞迁移,募集机体成熟的树突状细胞和T细胞,延长细胞存活和抗细胞凋亡的作用。本团队前期研究表明,IBDV感染后,CCL19表达水平显著上升,参与T细胞迁移浸润法氏囊的过程。IBDV VP2基因编码病原的主要结构抗原蛋白VP2,是研究IBD DNA疫苗的主要免疫原基因。因此,本研究构建了p VAX1-VP2-CCL19质粒,并对其免疫原性进行了研究。1.p VAX1-VP2-CCL19的构建。参照Gen Bank已发表的IBDV VP2和CCL19序列设计引物,进行RT-PCR扩增得到VP2基因,再从实验室保存的p CAGGS-CCL19质粒中进行PCR扩增得到CCL19基因,用FDA推荐的可以用于人体的实验的载体质粒p VAX1,通过酶切连接的方式构建重组质粒p VAX1-VP2、p VAX1-CCL19。然后再通过IRES序列将VP2和CCL19共同串联到p VAX1真核表达载体上,构建重组质粒p VAX1-VP2-CCL19。体外转染DF-1细胞,48 h后分别用VP2和CCL19的抗体进行进行间接免疫荧光实验检测VP2基因与CCL19基因的表达情况,结果表明构建的重组质粒p VAX1-VP2-CCL19、p VAX1-VP2、p VAX1-CCL19具有表达活性。2.重组质粒pVXA1-VP2-CCL19对免疫原性的影响。选取50只1日龄洛岛红蛋鸡,随机分为5组,空白对照组（A组）、p VAX1-VP2组（B组）、p VAX1-VP2+p VAX1-CCL19组（C组）、p VAX1-VP2-CCL19组（D组）和B87疫苗组（E组）。按照常规饲养至14日龄,重组质粒每只鸡用100 ug的注射剂量免疫,B87疫苗组按照说明书以每只鸡0.2 m L的剂量进行免疫,28日龄使用相同剂量进行加强免疫。在免疫后的7 d、14 d、21 d和28 d进行翅静脉采血分离血清,ELISA检测血清中各指标的水平。结果表明,随着免疫次数和免疫时间的增加,各免疫组VP2抗体水平呈上升趋势,在免疫后21 d达到峰值。D组与B、C、E组相比,在各时间点,VP2抗体水平最高,与B组之间差异显著,在14 d时差异最明显。在免疫后的7 d和14 d,IL-4、IL-10浓度D组比B、C组显著提高100 ug/m L以上（P＜0.05）,与E组相比,只有免疫后的21 d差异显著（P＜0.05）。ELISA检测CD3+、CD4+、CD8+,D组与B组相比,第一次免疫后的7 d和14d CD3+浓度显著升高2倍左右,与C组和E组CD3+浓度无明显差异;D组CD4+浓度在7 d、14 d、21 d显著高于B、C组,与E组无差异;CD8+浓度各免疫组之间无差异。ELISA检测免疫球蛋白Ig G,D组与B、C组相比,在免疫后的7 d和21 d Ig G浓度显著升高（P＜0.05）,在28 d时浓度达到1700 u/m L左右,E组除免疫后的21 d浓度高出D组400 u/m L左右,其余时间点无差异。3.pVXA1-VP2-CCL19对IBDV BC6-85攻毒后的保护作用。42日龄进行IBDV BC6-85毒株攻毒,攻毒剂量为每只鸡0.1 mL,病毒含量为5 ELD50/0.2 m L,在攻毒后的5 d、7 d和9 d翅静脉采血分离血清,进行ELISA检测。结果表明,D组CD3+浓度在各时间点都高于B组15 u/m L左右,与C组、E组水平相当;D组CD4+浓度高于B组、C组5 u/m L以上,且差异极显著（P＜0.01）,与E组水平相当;CD8+浓度各免疫组间差异不显著。ELISA检测免疫球蛋白Ig G,在攻毒后的7 d和9 d,D组Ig G浓度显著高出B组600 u/m L以上,与C组、E组差异不显著。脾脏、胸腺、法氏囊器官指数测定结果表明,D组与E组无差异,但与B组、C组相比,法氏囊指数显著提高。半定量RT-PCR检测攻毒后5 d、7 d法氏囊中VP2基因的相对含量,结果表明,各免疫组与空白对照组相比,VP2含量下降10倍左右,其中D组与B组、C组、E组相比,VP2含量最低,病毒清除的较快。结论:构建的pVXA1-VP2-CCL19重组质粒,具有增强鸡体免疫原性和保护IBDV BC6-85攻击作用,为进一步研究IBD重组DNA疫苗奠定了基础。
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