研究目的癫痫是一种非常严重的脑功能紊乱,有多种发作类型和癫痫综合征。神经周围网络(PNNs)被认为是细胞外基质(ECM)结构,环绕在小清蛋白阳性抑制性中间神经元的周围,在神经细胞的发育起着至关重要的作用,有促进中枢神经系统的成熟过程中突触可塑性形成。硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)是神经网络至关重要的成分,它被认为是一种内源性突触可塑性的生长因子。异常的神经网络信号会导致的中枢神经系统的功能障碍,包括癫痫、中风、阿尔茨海默病、精神分裂症和成瘾。植物凝集素中的紫藤多花凝集素(WFA)可利用N-乙酰氨基半乳糖残基于神经网络的结合,从而使神经网络可视化。因此,我们在目前的研究中用紫藤多花凝集素(WFA)标记的神经元对神经网络进行评估。此外,三中细胞外基质ECM的主要成分:聚集蛋白聚糖(aggrecan),腱糖白蛋-R(tenascin-R,)和神经蛋白聚糖(neurocan),对于神经网络的形成和稳定起到了非常重要的作用。戊四唑,Y-氨基丁酸受体拮抗剂(PTZ),广泛用于建立实验模型,模拟人类癫痫。高剂量的戊四唑(PTZ)可以增加兴奋性谷氨酸递质和诱导全身强直阵挛发作。在目前的研究中,我们使用戊四唑(PTZ)在50mg/kg的剂量(IP)导致慢性癫痫发作,观察NBQX抗癫痫作用以及神经网络参与作用。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体的拮抗剂2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰-苯喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)在大鼠模型中可以降低自发性痫性的反复发作,但是NBQX在大鼠慢性癫痫模型中的对抗癫痫的机制还不清楚。神经元周围网络(PNNs)是一种特殊的神经细胞外基质,围绕在小清蛋白阳性的抑制性中间神经元的周围,同时在神经元细胞的发育和突触可塑性方面发挥了非常重要的作用。我们研究目的是应用戊四唑(PTZ)诱导慢性癫痫发作,观察NBQX抗癫痫作用以及神经网络参与作用。用紫藤多花凝集素(WFA)标记的神经元对神经网络进行评估,了解神经周围网络在癫痫治疗中的作用主要集中在神经周围网络在癫痫治疗中的作用,如果我们能够通过研究确定这些分子通路在神经周围网络中的作用,就可以通过调控这些通路来控制神经周围网络的功能,进而为癫痫的治疗提供一个新的靶点或者方向。研究方法(一)实验模型的建立在实验进行之前12个小时之内需要剥夺动物的饮食,不剥夺动物的饮水。戊四唑组的动物每天给予大鼠戊四唑腹腔注射(50mg/kg),连续28天的时间来建立慢性癫痫的动物模型。对照组的大鼠给予生理盐水注射,连续28天的时间。在第29天和第30天的时候进行行为学的测试和神经生化的分析。为了观测NBQX在戊四唑诱导的慢性癫痫模型中的抗癫痫的作用。我们将大鼠分为四个组。生理盐水腹腔注射建模+腹腔注射生理盐水干预组;戊四唑(50mg/kg)腹腔注射建模+腹腔注射生理盐水干预组;生理盐水腹腔注射建模+腹腔注射NBQX组;戊四唑(50mg/kg)腹腔注射建模+腹腔注射NBQX组。在第30天结束后2天的时候进行行为学的测试和神经生化的分析。为了观测在戊四唑诱导的慢性癫痫模型中ChABC在mPFC引起PNNs衰退。我们将大鼠分为四个组。生理盐水腹腔注射+青霉素酶干预组(在第24天注射青霉素酶);ChABC腹腔注射+腹腔注射生理盐水干预组(ChABC0.01 U/μg/side/0.5μl,在第24天注射);青霉素酶腹腔注射建模+戊四唑腹腔注射组(前28天注射戊四唑(50mg/kg),在第24天注射青霉素酶);戊四唑(50mg/kg)腹腔注射建模+腹腔注射ChABC组(前28天注射戊四唑(50 mg/kg),在第24天注射ChABC)。在第30天结束后2天的时候进行行为学的测试和神经生化的分析。为了观察在戊四唑诱导的慢性癫痫模型中ChABC在mPFC引起PNNs衰退可以逆转NBQX的抗癫痫作用。我们将经过28天戊四唑(PTZ)注射的大鼠分为四个组。空白对照物(无NBQX)腹腔注射+青霉素酶干预组(在第24天在mPFC注射青霉素酶);ChABC+空白对照物腹腔注射干预组(ChAB在第24天注射);青霉素酶腹腔注射+NBQX腹腔注射组(在第24天注射青霉素酶,第29-31天注射NBQX);NBQX腹腔注射+腹腔注射ChABC组(在第24天将ChABC)注射至mPFC,在第 29-31 天将 ChABC+NBQX(20 mg/kg,i.p.)注射至 mPFC。在第 32天结束的时候进行行为学的测试和神经生化的分析。(二)诱导癲病的发作和行为分析戊四唑(PTZ)诱导癫痫发作,可以表现为静止期也就是延迟发作(S),小发作的持续时间期(s),大发作持续时间期(S),和戊四唑(PTZ)注射后1h癫痫发作的严重程度评分。轻微的癫痫发作被称为孤立的肌阵挛和强直阵挛发作伴有面部和前下肢肌肉的阵挛。而大癫痫发作的特点是持续的头、颈、尾部的肌肉的强直-阵挛发作。分数是用来衡量癫痫发作按以下级发作的严重程度:Racine痫性发作分级标准:0级:无惊厥1级:咀嚼、眨眼、立须等面部肌肉的抽搐2级:以点头运动为主的颈部肌肉的抽搐3级:单侧前肢的阵挛、抽搐4级:双侧前肢阵挛、抽搐伴身体立起5级:双侧后肢强直、身体背曲强直、跌倒在整个实验过程中,每只大鼠的发作行为记录由一个视频摄像机记录。(三)组织样品的制备在戊四唑(PTZ)最末次给药30min后,处死试验大鼠,获取试验大鼠的大脑。随后,在-20℃的低温恒温器中,制作大约1mm厚度的内侧前额叶皮质(mPFC)冠状位切片。获取冠状位切片大约距离前囟3.8mmm。将大鼠脑组织匀浆被裂解蛋白酶抑制剂RIIPA裂解液裂解后与电分散混合30分钟。随后,在4°C对大鼠脑组织匀浆进行10,000×g容离心20分钟以上。以上所有的程序都是在较低温度下进行(0-4℃)。采用BCA试剂盒测定各样品的蛋白浓度。RIPA裂解液通过被稀释的样品达到蛋白质的浓度的标准。(四)脑内插管和颅内注射用戊巴比妥钠(60mg/kg,腹腔注射)麻醉大鼠,引导插管植入双侧1mm以上的立体坐标的内侧前额叶皮质:前/后(A/P),3.2mm;内侧/外侧(M/L),±2.5mm;背/腹侧(D/V),3.3mm,(28-30)。大鼠在颅内注射前被允许休息恢复至少7天。空白对照物或ChABC通过颅内注射用10ul汉弥尔顿注射器,聚乙烯-50注射器连接30号引导插管(Plastics One)到立体定向内侧前额叶皮质的。ChAB C的注射剂量参考既往研究的剂量。总体的注射剂量为为0.5ul,每一侧的注射时间在1min以上,为了更好地扩散,注射器被留在原地的至少1分钟。在观察评估行为测试后,将大鼠用戊巴比妥钠麻醉(100 mg/kg,i.p)。在套管植入位置约30um处,进行NIssl染色,并在光学显微镜下对灌注部位进行评估。错位的套管被排除在统计分析之外。(五)Western Blot 检测组织样品在经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,在80V基层缩胶约30分钟,120V在溶解凝胶约1小时左右处理。蛋白电泳转移到I-P转印膜在0.25A电流下3小时。膜用TBST(pH7.4)洗涤,并在浸渍在封闭液中4℃室温过夜。在室温状态下,将凝胶膜在5%的牛血清白蛋白的TBST中,加入抗腱糖蛋白受体抗体、抗蛋白聚糖,抗神经蛋白聚糖,和抗肌动蛋白抗体。凝胶膜在TBST缓冲液震动洗涤4-6分钟后,印迹在室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗;随后印迹继续用TBST震动洗涤4-6分钟。接下来,印迹与超信号增强化学发光底物混合物在室温下放置1分钟。最后,印迹暴光,洗出X胶片光片。用Quantity One软件量化(版本4.0.3)处理。(六)免疫荧光和图像分析行为测试后,大鼠用戊巴比妥钠(100 mg/kg,i.p.)麻醉后,经心脏灌注200-250ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4),然后再用200-250ml 4%多聚甲醛磷酸缓冲液(pH 7.4)灌注。将大鼠脑组织在温度4℃条件下放置至少24小时,随后用30%蔗糖进行脱水处理至少4天。使用徕卡冷冻切片机取一系列包含中内侧前额叶皮层厚度为30um的冠状位脑切片,并储存在-20℃的冷冻保护剂溶液中。切片在温度为4℃时,在生物标记素凝集素多花紫藤溶液(WFA)的溶液中过夜。所有的切片,在温度是25℃条件下,经过PBS洗涤3次,加入FITC标记的链霉亲和素,并且需要3小时的时间完成。选取每一只大鼠各脑区的4-5个切片,使用荧光显微镜和图像分析程序,来测量WFA表达阳性的神经周围网络(PNNs)。根据既往研究报告,对目标区域的任何一侧的脑组织神经周围网络(PNNs)的阳性表达代表了免疫反应阳性细胞数。统计学处理计量资料以均数±标准差(x±s)表示各组水平,采用SPSS16.0软件进行统计学分析。对两样本均数的比较采用t检验,对多个样本均数的比较选择单因素方差分析(one-way ANOVA),其中多组间比较采用Newman-Keuls检验。设定P<0.05为有统计学差异。研究结果1、戊四唑(PTZ)诱导的癫痫的模型与人类发癫痫作类似,是理想的研究癫痫模型。2、戊四唑(PTZ)诱导的慢性癫痫模型中,发现了前额叶内侧皮质(mPFC)中的PNNs(WFA+)的衰退,以及腱糖蛋白-R,聚集蛋白聚糖和神经蛋白聚糖表达的减少。3、戊四唑(PTZ)诱导的慢性癫痫模型中AMPA受体拮抗剂NBQX可以使癫痫发作减少。4、NBQX增加mPFC中PNNs(WFA),腱糖蛋白-R,聚集蛋白聚糖和神经蛋白聚糖表达。5、戊四唑(PTZ)诱导慢性癫痫发作中,软骨素酶ABC(ChABC)可引起mPFC中的神经网络的衰退。6、戊四唑(PTZ)诱导的慢性癫痫发作中,ChA1BC可以逆转NBQX抗癫痫作用。研究结论及意义目前的数据表明,在戊四唑(PTZ)诱导的慢性癫痫模型中,AMPA受体拮抗剂NBQX通过调控内侧前额叶皮质神经周围网络功能来减少癫痫发作。软骨素酶(ChABC)可以引起内侧前额叶皮质(mPFC)中神经周围网络(PNNs)的衰退,从而加剧了癫痫发作,也同时逆转了 AMPA受体拮抗剂NBQX抗癫痫作用。这些结果表明,在内侧前额叶皮质神经周围网络(PNNs)的抗痫作用是通过AMPA受体拮抗剂NBQX来实现的。这些发现表明前额叶皮层(mPFC)的神经周围网络(PNNs)的功能在癫痫的病理生理之中发挥了非常重要的作用,激活神经周围网络可能会有效地治疗癫痫。