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梨小食心虫Grapholita molesta(Busck)是一种以蔷薇科核果类和仁果类果树为主要寄主的蛀食性果树害虫,给桃、梨、李等水果生产造成了重大的经济损失。在桃梨混栽区,梨小食心虫具有明显的转移寄主危害习性,春季至仲夏(前3代)主要为害桃梢,之后陆续转移至梨园为害(第4~5代),寄主植物挥发物组分随季节性变化是诱导梨小食心虫转移寄主危害的重要因素,明确梨小食心虫识别寄主植物挥发物的分子机制对开发基于植物源引诱剂的生态调控技术具有重要意义。触角是昆虫主要的嗅觉器官,其上分布着多种感觉器,感觉器淋巴液中浸渍着多种与嗅觉相关的蛋白,如气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、气味受体(olfactory receptors,ORs)、离子受体(ionontropic receptors,IRs)、感觉神经元蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPs)及不同种类的气味降解酶(odorant degrading enzymes,ODEs)。水溶性的小分子OBPs能够选择地结合外界环境中的疏水性的气味分子,然后将其运输穿过亲水性的淋巴液到达至位于感觉神经元膜上的气味受体上,激发信号传导,引发后续的行为反应。OBPs在昆虫嗅觉系统中起着“身份检验员”和“运输工”的角色,能够保证外界环境中对特定昆虫有活性的少量气味分子进入感觉器内部;ORs对气味分子的识别更具特异性,能够将活性气味分子的化学信号转变为电生理信号,从而引发信号传导及其后续的加工处理。OBPs和ORs在昆虫的嗅觉通讯中至关重要。前人已对梨小食心虫触角中高丰度表达的OBPs和CSPs的生理功能进行了研究,本论文主要对触角中低表达或非触角特异性表达的OBPs的结合功能进行了研究,旨在明确这些蛋白在识别寄主植物挥发物特异性组分或微量组分中的作用。此外,利用RNAi技术研究了共同受体Orco在识别挥发物中的生理功能,主要研究结果如下:在注释梨小食心虫触角转录组获得候选嗅觉相关基因的基础上,克隆并测序验证了8种GmolOBPs(GmolPBP1;GmolOBP4;GmolOBP5;GmolOBP7;GmolOBP10;GmolOBP12;GmolOBP14;GmolOBP16)的完整编码序列。经多序列比对和系统进化树分析结果发现在GmolOBP14中仅有4个保守的半胱氨酸残基,在进化树中聚类至Minus-C OBP亚家族独立进化枝,表明GmolOBP14属于Minus-C OBP。其他OBPs均具有6个保守的半胱氨酸残基,属于典型的Classic OBP亚家族基因。与其他OBPs相比,GmolOBP7属长OBPs,其编码区为504 bp的核苷酸编码167个氨基酸,但信号肽分析表明GmolOBP7 N-端无信号肽,为了进一步验证该蛋白是否具有信号肽,利用5′RACE在编码区5′端扩增获得了281 bp的DNA片段,Signal P预测确认该蛋白N-端无信号肽。荧光定量PCR结果表明,GmolPBP1、GmolOBP4、GmolOBP5、GmolOBP10、GmolOBP12和GmolOBP16在触角中的表达量相对较高;GmolOBP7在雄虫翅和雌雄虫触角中的表达量高,在雌雄触角的表达量差异不显著;GmolOBP14在雄虫翅中的表达量显著高于成虫触角的表达量,分别是雌雄虫触角表达量的2.84和6.98倍,推测GmolOBP14除具有嗅觉生理功能外,还具有识别非挥发性寄主代谢物的味觉功能。GmolPBP1、GmolOBP4、GmolOBP5和GmolOBP12在雄虫触角中的表达量显著高于雌虫,分别是雌虫触角的9.47、1.73、2.46和2.92倍;GmolOBP10和GmolOBP14在雌虫触角中的表达量分别是雄虫触角表达量的2.00和2.46倍,表明以上6种OBPs在雌雄虫触角中功能不尽相同。通过原核表达系统成功表地达了梨小食心虫的8种GmolOBPs,其中GmolOBP7以可溶的形式存在,其他重组OBPs均以包涵体的形式存在,通过变性、复性、蛋白纯化获得了有活性的融合蛋白。荧光竞争结合试验发现,GmolOBP4、GmolOBP12和GmolOBP16能够强烈结合性信息素顺-8-十二碳烯-1-醇((Z)-8-dodecenyl alcohol,Z8-12:OH),解离常数(K_i)分别为6.19、2.73和7.76μM;GmolOBP7和GmolOBP10对次要性信息素组分1-十二烷醇(1-dodecanol,12:OH)具有结合活性,K_i别为9.27和5.10μM;GmolOBP5与GmolOBP14对4种性信息素均无结合活性,表明它们不参与对性信息素的感受和识别。7种GmolOBPs与30余种桃、梨挥发物的竞争结合试验表明,GmolOBP4与待测气味配体的结合能力较弱,与己醛(K_i=16.60μM)和梨酯(K_i=15.75μM)具有中等程度的结合活性;GmolOBP5结合谱较窄,仅能微弱地结合35种气味配体的9种;GmolOBP7与十二醛、梨酯和α-罗勒烯具有强烈的结合活性,解离常数分别为6.21、2.75和9.52μM。RNAi试验进一步证实,GmolOBP7在雄虫识别次要性信息素12:OH,雌雄虫识别寄主植物挥发物梨酯中起着重要作用;GmolOBP10与1-己醇、1-癸醇和α-罗勒烯的结合能力最强,K_i分别为5.19、9.92和10.89μM;GmolOBP12与反-2-己烯醛、苯甲醛、正己醇、乙酸-顺-3-己烯酯的结合能力最强,K_i分别4.21、6.81、4.68和4.68μM;GmolOBP14和GmolOBP16除能结合梨酯外,与其他挥发物的结合能力相对较弱。1-己醇是桃梢、梨果释放的重要绿叶挥发物,前期试验发现GmolCSP8能够特异性结合1-己醇,此次利用同源建模、分子柔性对接、定点突变等技术对GmolCSP8结合1-己醇的分子机制进行了进一步探究。首先以沙漠蝗SgreCSP4的晶体结构为模板构建了GmolCSP8的3D结构模型,通过分子柔性对接发现Thr27、Leu30、Val40、Leu80等残基可能是结合1-己醇的重要位点。将Thr27突变为Ala27后突变体GmolCSP8-T27A失去与1-己醇的结合能力,表明Thr27是GmolCSP8结合1-己醇的关键位点;将Leu30突变为Ala30后突变体GmolCSP8-L30A对1-己醇的结合能力下降了约6倍,表明Leu30对GmolCSP8结合1-己醇有明显影响。将Val40和Leu80突变为Ala40和Ala80后,突变体蛋白对1-己醇的结合能力未发生显著变化,表明Val40和Leu80不是GmolCSP8结合1-己醇的关键氨基酸残基。以梨小食心虫雌虫触角cDNA为模板克隆获得了GmolOrco的完整编码序列(Genbank No:GmolOR2,MG581972),其ORF长1422 bp,编码473个氨基酸残基。多序列比对发现GmolOrco与其他昆虫Orco的同源性较高,其中与苹果蠹蛾和葡萄花翅小卷蛾的Orco序列一致性分别高达96%和91%;进化分析表明不同昆虫种类的Orco均聚类到独立的进化枝,暗示其在进化上较为同源。梨小食心虫GmolOrco在成虫不同组织和不同虫态中的表达量测定表明,GmolOrco主要在触角中表达,且在雄虫触角的表达量显著于高于雌虫(P<0.05);在梨小食心虫不同虫态中均检测到GmolOrco的表达,但在成虫中的表达量最高,其次在卵和5日龄蛹中。利用RNAi结合触角电位反应试验研究了GmolOrco的嗅觉功能,与注射GFP-dsRNA和未注射组的试虫相比,发现注射GmolOrco-dsRNA的雄虫对性信息素Z8-12:Ac和Z8-12:OH的触角电位反应值(EAG response values)显著降低(P<0.05),表明GmolOrco直接参与了雄虫对雌虫性信息素的识别;注射GmolOrco-dsRNA的雌虫对寄主植物挥发物乙酸-顺-3-己烯酯的EAG反应值降低了47.74%,表明GmolOrco在雌虫中亦具有识别寄主植物挥发物的功能。