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背景：随着现代人生活习惯与饮食的改变,以及外界环境变化的影响,冠心病(coronary artery disease, CAD)作为高致死性疾病,发病率呈逐年上升趋势。尽管外科或介入治疗是高效的,但从长远看,仍无法满足那些最终丧失这些治疗机会的病人。因此,这些患者迫切需要一种新而有效的治疗方式。已证实,建立在分子生物学研究基础上的血管重建可以改善心血管或外周血管动脉粥样硬化造成的缺血。血管新生基因治疗能够干预缺血性疾病的进程,重建功能性微循环网络,起到预防和治疗的作用。目前,成熟性微血管已经成为治疗血管新生的重要靶点。参与微血管新生的因子有很多。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是被广泛认知的促血管生长因子,能促进内皮细胞(endothelial cells, ECs)存活、增殖和迁移,引导新生血管向缺血区域延伸。血管生成素家族(Angiopoietins)一方面参与内皮的活化(Ang2),另一方面还促进内皮的稳定(Ang1)。血小板源生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)在Ang1的刺激下介导壁细胞(Mural Cells, MCs)募集。Apelin (APLN)既促进内皮的增殖、融合,形成新的管腔,又加强ECs间及ECs与MCs间的连接。血管新生是一个多种分子参与的复杂过程。单分子因素往往由于自身的局限性而影响了新生血管的结构和功能。比如,VEGF-A促进新生血管生长的同时导致血管通透性增加；Ang2介导血管新生的同时造成MCs的脱离。目的：本实验通过对重组腺相关病毒携带VEGF-A、Ang2、Ang1和APLN四种不同基因进行选择性结合,来调节血管新生过程中内皮去稳定和稳定间的平衡。探讨多基因治疗血管新生在缺血性疾病的微循环中的作用,从而制定出干预和治疗缺血性疾病的最佳策略。方法：1.不同靶基因在体外对ECs成管及其周围PCs的影响1)选取人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cels, HMECs)、小鼠脑内皮细胞3(brain endothelial cells, bEnd.3)、鼠源周细胞(C3H/10T1/2),采用荧光活化细胞分选技术(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)检测细胞表面Tie2、PDGFR受体。2)应用瞬时转染技术(transient transfection),(?)将质粒pCMV-VEGF-A、pCMV-Ang2、pCMV-Ang1和pCMV-APLN以单独或结合方式分别转入HMECs和bEnd.3中培养48h。3)应用实时定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)明确靶基因过表达的构建。4)建立2D基质胶(matrigel)模型,评估过表达VEGF-A、Ang2、Ang1和APLN对两种ECs的成管作用。5)PCs与ECs管样结构共培养,评估VEGF-A、Ang2、Ang1和APLN对PCs的募集作用。2.多基因结合促成熟血管新生在小鼠缺血后肢微循环中的影响1)以腺相关病毒(adeno-associated virus vector, AAV)为载体,并联合Tetoff体系,重组、合成、生产及纯化病毒rAAV-CMV-hVEGF-A、rAAV-CMV-mAng2、rAAV-CMV-mAPLN、rAAV-CMV-hAng1、rAAV-CMV-tetoff-mAng2和rAAV-CMV-LacZ。2)选取C57BL/6J雄性小鼠,右肢肌肉内注射病毒,左肢注射0.9%生理盐水(NaCl).病毒浓度为每只鼠：VEG-A F(?)低剂量组5×1011病毒颗粒(virus particles, vps)、 VEGF-A高剂量3×1012vps,其余靶基因病毒分别为3×1012vps。饲养14天。3)14天后,每组随机选择3只小鼠处死,取后肢肌肉组织行qRT-PCR检测,LacZ过表达小鼠做β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-Gal)组织学染色,明确靶基因的表达。其余小鼠通过股动脉结扎建立后肢缺血模型。右侧为结扎侧,左侧为伪手术对照侧。术后继续饲养。4)分别在结扎前及结扎后d0、d7、d14,采用激光多普勒血流成像技术(laser Doppler imaging, LDI)检测血液灌注情况。5)在结扎后d3时,对于rAAV-tetoff-mAng2过表达小鼠,取3只小鼠的后肢肌肉组织做qRT-PCR检测Ang2表达水平。其余给予喂食含多西环素(Doxycycline, Dox)的食物,于d7再次取3只小鼠的后肢肌肉组织做qRT-PCR检测Ang2含量,余下小鼠继续进行实验。6)分别在d7和d14处死小鼠,取后肢腓肠肌(gastric muscle, GC)做冰冻切片。分别使用ECs标记物PECAM-1和PCs标记物NG2的抗体,对组织切片进行免疫荧光染色(Immunofluorescence staining, IFS),在荧光显微镜下采集图片,观察阳性细胞数量并计算。结果：体外实验1.Ang2本身无成管作用,且不影响VEGF-A和APLN所介导的ECs毛细血管样管腔的显著增加,却竞争性抑制Ang1；2. Ang1和APLN都显著增加了PCs募集数量,VEGF-A和Ang2对此无影响；3.无论同源还是异源细胞共培养,Ang2均抑制Ang1和APLN对PCs的募集作用；体内实验1.尽管VEGF-A显著地增加了毛细血管密度,但它无法促进小鼠缺血后肢的血流灌注；Ang2的结合提高了VEGF-A的促血管新生作用,但下调了PCs的募集,而无法促进缺血灌注显著改善,甚至在早期(d7)使恢复情况恶化；2. APLN显著地恢复了缺血后肢的血流灌注,增加了毛细血管密度及PCs的募集；APLN/Ang2持续表达增加了毛细血管密度,但降低了PCs的募集,使早期(d7)血流灌注较APLN明显下降。虽然后期(d14)较正常对照组显著升高,但较APLN相比无统计学意义；3.在早期,APLN结合短暂性表达的Ang2与正常对照组和结合持续性表达的Ang2相比较,显著提高了PCs的募集。并且,明显增加了正常对照组和APLN所诱导的毛细血管密度,但血液灌流仅出现恢复升高的趋势；在后期,APLN结合短暂性表达的Ang2对毛细血管的促进作用仍在持续,但对PCs的募集和血流的灌注无显著性增加。4.早期过表达Ang2(d0-3)与持续性表达的Ang1结合与正常对照组相比,显著增加了血液灌流,提高了毛细血管密度和PCs的募集；5.与正常对照组相比,Ang1与APLN结合明显增加了PCs,却抑制了毛细血管密度的增加,最终无法促进缺血灌注的改善。结论：1.在小鼠缺血后肢模型中,血管生长去稳定因子VEGF-A和Ang2结合应用无法促进血液灌流的恢复,归因于PCs的分离。2.促血管成熟因子APLN和Ang1结合应用过早稳定了血管内皮,抑制了新血管萌芽和生长,导致血液灌流障碍。3.早期过表达Ang2(d0-3)与后期过表达Angl结合,保证了缺血区内成熟微血管的重建,实现了内皮去稳定与稳定的动态平衡。创新点：1.我们证实了VEGF-A和Ang2两种去稳定因子结合应用对血管新生起负调节作用。2.首次结合应用APLN和Ang1,证明了过成熟化对血管新生过程的抑制作用。3.首次应用Ang1和Ang2相结合,揭示了治疗成熟的微血管新生的重大策略,即阶段依赖性的过表达去稳定和促成熟因子,为未来缺血性心脏病的基因治疗指导了方向。