糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病微血管并发症最严重的病变之一。增殖型糖尿病视网膜病变(PDR)以视网膜新生血管和纤维化为特征，最终可导致视网膜脱离，患者视力丧失，成为临床上致盲的主要原因。因此，对DR发病机制及防治的研究已经成为目前国内外的研究热点。新生血管形成是DR微血管病变的主要标志，分子生物学研究证实了生长因子在DR发生、发展中起到了非常关键的作用。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为强有力的内皮细胞分裂因子，除在促进内皮细胞增殖外，还能调节细胞外基质代谢、促进胶原Ⅱ、Ⅲ的降解。因此，bFGF在促进新生血管形成中发挥了重要作用，几乎作用于新生血管形成的全过程。而且bFGF在PDR的早期即发挥了重要作用，早于VEGF。二者不仅具有协同作用，bFGF还可以诱导内皮细胞表达VEGF。bFGF的靶器官除了血管内皮细胞、周细胞，还有色素上皮细胞和Müller细胞。其中，Müller细胞是视网膜胶质细胞的主要成分，从内界膜延伸到外界膜，贯穿于整个视网膜，对视网膜起支持、营养的作用，参与维持视网膜的完整性，最易于受异常生物学行为的影响，参与多种病理过程。DR的发病是一个很复杂的病理过程，一般认为，持续的高血糖是DR发生的先决条件，也是始动因素，血糖高低与DR呈正相关。因此，本实验通过兔糖尿病动物模型，研究糖尿病状态下，bFGF在视网膜细胞中表达的定位，以明吉林大学博士学位论文确DR形成过程中bFGF表达的变化。进一步以兔视网膜Muller细胞为实验模型，探讨在高糖状态下，Nmller细胞分泌bFGF的变化及其机制，以达到早期控制bFGF的产生进而治疗DR的目的，为临床工作提供理论依据，对及早防治DR，降低DR的发病率，提高糖尿病病人的生存质量具有重要意义。 一发现糖尿病动物模型视网膜并未发生明显的形态学改变时存在bFGF的表达，证实bFGF在PDR的早期即发挥作用。本实验采用激光共聚焦免疫荧光双重标记技术，研究糖尿病兔视网膜bFGF的表达及定位，发现bFGF与GR印共同表达于同一细胞，说明糖尿病早期时视网膜M叨er细胞即分泌bFGF。 二.建立体外培养兔视网膜Muller细胞的实验模型，排除体内因素影响以进一步研究高糖条件下视网膜Muller细胞分泌bFGF的情况。本实验经体视显微镜、培养基筛选，以及通过传代培养获得纯度较高的Nmller细胞。由于目前缺乏Nmller细胞特异性抗体，鉴定Muller细胞需依赖联合鉴定的方法。经G异印、5- 100、VII因子相关抗原、肌细胞特异性肌动蛋白的免疫细胞化学染色，PAS染色，透射电镜，及GFAP的免疫荧光染色证实，以组织块悬浮法获得的细胞为Muller细胞，其纯度达95%，为进一步研究提供成功的体外实验模型。 三.利用免疫细胞化学方法、RT一PCR方法观察5众mM高糖对体外培养的视网膜Nluller细胞bFGF表达的影响。免疫细胞化学结果发现，高浓度葡萄糖培养视网膜MOller细胞3天，bFGF蛋白质表达 (灰度值为1 92.4巧.6)与正常对照组(灰度值为170.3鲜.7)相比，具有显著性差异(称0.01);通过RT.pCR方法，观察到50mM葡萄糖培养Nmller细胞3天组与正常对照相比bFGF mRNA表达水平明显上调护<。.01)。c目phos石nC为特异性PKC抑制剂，soulM葡萄糖+50川叨CalPhostinC组与50血M葡萄糖组相比MOner细胞bFGF乡了吉林大学博士学位论文mRNA表达明显减少(尸<0.01)，说明高糖引起视网膜MOller细胞bFGF表达的增加一部分是通过PKC途径激活产生的，抑制PKC的活性可以抑制bFGF的产生，而达到抑制新生血管形成的作用。 四.采用TUNEL法检测凋亡细胞，结果发现，在糖尿病组视网膜内核层可见凋亡阳性细胞，由于N恤11er细胞胞体位于内核层，说明在糖尿病视网膜病变中可能存在着Nmller细胞的凋亡。50mM葡萄糖培养Muller细胞3天，透射电镜下深染细胞明显增多，细胞表面的微绒毛减少，变钝。细胞核缩小、不规则，核内常染色质增多，可见到染色质形成大小不等的的团块凝结、边聚于核膜处。胞质深染，可见高度扩张的粗面内质网。线粒体肿胀，晴断裂，呈空泡状改变。胞质内可见残余体。胞质的深染、细胞器的损害、细胞表面微绒毛的减少都表明细胞功能己发生减退。染色质边集是细胞凋亡典型的超微结构特征。说明高糖长时间作用于M公ller细胞，引起视网膜Muller细胞的凋亡而导致功能下降。该结果进一步证实TUN旧L实验中内核层的凋亡阳性细胞部分为M皿‘细胞。 五‘实验应用全细胞膜片钳技术，观察了Na+通道和Caz+通道，以发现高糖对视网膜MOller细胞离子通道的影响。结果发现，在高糖条件下，峰值Na+电流与正常对照相比明显降低(尸<0.01)，降低了25.58%。说明高糖使MUller细胞Na斗通道的开放概率降低，Na+内向电流减少，这可能是Moller细胞功能发生变化的一种早期机制。细胞C矛+通道开放概率没有明显变化，其中一个原因可能与研究例数较少有关，另一个原因可能是高糖刺激了钙库内钙的释放，引发了C扩十波，这种C扩十波担当了重要的钙信息传递，进而引起bFGF的分泌。 本实验采用激光共聚焦免疫荧光双重标记技术，研究糖尿病兔视网膜bFGF的表达及定位，发现bFGF与GEA