普通小麦(Triticum aestivum L.,2n=42,AABBDD)为异源六倍体,是我国及世界上许多国家最主要的粮食来源之一,为人类提供约20%的能量。由于其基因组庞大,遗传结构复杂,绝大多数基因都存在多个拷贝,因此利用传统的正向或反向遗传学手段难以满足小麦基因组功能的解析及性状改良,致使小麦基因组研究远远落后于玉米、水稻等其他粮食作物。随着小麦全基因组测序、组装及注释工作的陆续完成,建立一种高效的反向遗传学手段将成为小麦基因组学研究与遗传改良的关键。基因编辑技术特别是成簇规律间隔的短回文重复序列及相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9system),是目前基因突变或改造基因最具潜力的技术体系,具有特异性好、效率高以及高通量的特点。目前该技术在动物、植物研究中被广泛应用,为基因功能研究及遗传改良提供了新的技术与思路。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以TaCKX1为目标基因,在实验室前期工作的基础上,成功构建了济麦22号小麦品种TaCKX1基因靶向编辑载体,并建立了完整的小麦幼胚离体培养再生体系。为快速、高效检测载体编辑效率,建立了一套较为完整的小麦叶肉细胞原生质体制备和瞬时表达技术操作流程。同时,本研究还对经过外显子捕获测序的部分济麦22号TILLING突变株进行了突变位点检测。主要结果如下:1.小麦幼胚离体培养再生体系的建立为搭建济麦22号小麦品种有效基因转化平台,本研究对小麦幼胚再生体系进行了探究试验,结果表明在MS基础培养基中添加2,4-D(2.0 mg/L)、脯氨酰胺(500mg/L)、谷氨酰胺(500 mg/L)、水解酪蛋白(300 mg/L)后,愈伤组织平均出愈率达92.2%,并产生颜色淡黄,表面多瘤状突起的胚性愈伤组织。在MS培养基中同时添加天冬酰胺和水解酪蛋白愈伤诱导效果要优于单独添加水解酪蛋白。在不添加任何激素的MS培养基中,小麦幼胚愈伤组织分化效率明显高于添加激素的分化培养基。2.TaCKX1基因靶向编辑载体的构建以TaCKX1为目标基因,在第一外显子共设计合成6对靶向编辑sgRNA并分别插入到pTaU6-sgRNA载体骨架。后将带有同源臂的特异性引物所扩增出的靶序列-gRNA片段定向插入载体骨架pYAO-Cas9。测序结果显示TaCKX1基因CRISPR/Cas9重组表达载体构建成功,为后续对于该基因的功能解析及育种应用奠定了基础。3.小麦原生质体的瞬时表达为对所构建的TaCKX1基因重组表达载体的编辑效率进行检测,通过正交和随机设计试验分析了小麦叶肉细胞原生质体制备过程的影响因素,确定了包括取材幼苗苗龄、取材叶位、酶解液渗透压、酶浓度和酶解时间等因素的最佳参数组合,分析了各因素影响原生质体产量的效应大小,建立了一套较为完整的小麦叶肉细胞原生质体制备和瞬时表达技术流程。综合分析正交试验和随机设计试验结果发现:苗龄为7 d的小麦第一片真叶,在纤维素酶浓度(M/V)1.5%、离析酶浓度(M/V)0.75%、甘露醇浓度0.8 mol/L条件下,固定酶解时间为5 h时,分离得到的原生质体最为完整且数量最多。经PEG介导,可实现GFP质粒AN580在原生质体内的瞬时表达,使济麦22号小麦叶肉原生质体的转化效率约达到40%。4.TaCKX1基因突变位点的检测对本实验室经过外显子捕获测序的部分TILLING TaCKX1突变株系进行突变位点检测发现:经检测的13个株系中,在A亚基因组中有2个突变株系存在单碱基突变位点,B亚基因组有4个突变株系存在单碱基突变位点,D亚基因组中有5个突变株系存在单碱基突变位点。对TaCKX1基因突变位点的检测,为后续对于该基因功能的研究及济麦22号小麦的品种改良奠定了基础。