血浆DNA直接芯片PCR扩增和微流控化学发光SNP分析系统的研究

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核酸是一类重要的生物分子,其分析一直受到人们的关注。核酸分析的发展离不开先进的分析仪器与技术,而仪器设备的微型化和集成化是一个日益明显的发展趋势,微全分析系统的提出和发展就是这一趋势的体现。血液是临床常用的检测样本,血浆DNA是血液细胞外的DNA,因为血浆DNA在疾病检测和预估方面的独特意义,近年来医学界对它的研究日益增多。本文在静态微池PCR芯片技术的基础上建立了血浆游离DNA的直接扩增方法;为了进一步对DNA进行分析,建立了微流控发光核酸分析系统,并初步用于核酸SNP位点的检测。基于血液直接扩增和芯片PCR研究,建立了静态微池PCR芯片上血浆DNA直接扩增方法。将λDNA(扩增片段为236bp)添加于血浆中,形成游离DNA模拟样品,通过改变PCR程序,优化反应体系,建立了直接血浆DNA扩增方法。该方法成功用于血浆中DYZ-1型基因(扩增片段为149bp)的直接扩增,以凝胶电泳作为检测手段,在25μL扩增反应体系中,发现血浆量在0.1-16.71μL之间均得到目标扩增产物。并在芯片上成功地进行λDNA和DYZ-1型基因的直接扩增,扩增结果分别用凝胶电泳和芯片毛细管电泳进行了检测。基于焦磷酸测序化学发光反应,利用磁定位固定方法在毛细管中制作了微反应器,建立了微流控发光分析系统。首先探讨了微反应器的制作,包括高梯度磁固定玻璃芯片、高梯度磁固定PDMS-ITO玻璃芯片和毛细管微反应器的制作。以毛细管作为试剂输运和发光反应的基本平台,永磁铁在毛细管两侧以相吸模式加磁固定磁珠模板,用磁屏蔽盒消除磁场对光电倍增管的可能干扰,建立微流控核酸发光分析系统。利用此系统,借助BAMPER法(结合修饰引物延伸反应的生物发光分析检测)对来自人血液的21号染色体rs8130833的SNP位点进行了检测。与基于静态发光反应的方法相比,该方法具有简单快速的特点。
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