色谱分离小分子类溶质时,分离度随着柱长的增加而增加,但用色谱分离纯化生物大分子时,根据短柱理论,分离度基本上与柱长无关,而且有时可以得出短柱的分离度较长柱好的情况,短柱分离时,扩散较长柱小,研究小分子类溶质在柱中的扩散规律对于生物大分子的短色谱柱理论研究很重要。本文研究内容包括三部分: 1.疏水短柱分离纯化蛋白质 用PEG-600型疏水填料装填色谱柱,长柱装填大颗粒(L-L),短柱装填小颗粒(S-S),分离五种标准蛋白,对比两种色谱柱分离效果,结果发现两者都具有很好的分离度。由于(S-S)相比于(L-L)较小的传质扩散,所以前者比后者的分离效果更好一些。 用1mm,2mm,5mm不同长度的色谱柱(S-S)分离标准蛋白,比较分离效果,结果发现当柱长减小到仅1mm长时,仍然具有很好的分离效果。最后用2mm长的小颗粒PEG-600疏水色谱柱成功地分离纯化重组人干扰素-γ,在10min左右时干扰素-γ被洗脱,目标峰纯度达到92%。 2.反相色谱中分离小分子类溶质的研究 用3cm,5cm,10cm,15cm,20cm,25cm六根不同长度的反相色谱柱,以甲醇-水为流动相,在不同的流动相流速和甲醇浓度时分离苯、甲苯、萘、联苯四种溶质,研究了等度洗脱时半峰宽与保留时间,流动相流速、柱长之间的关系。经作图后发现:(1)半峰宽与保留时间的平方根之间存在线性关系;(2)甲醇浓度相同,流动相流速不同时,半峰宽与流速倒数的平方根之间也存在线性关系;(3)洗脱剂浓度,流动相流速相同时,半峰宽与柱长的平方根均呈线性关系。 用发现的几种线性关系分别对半峰宽进行了预测。最后考察了线性方程的斜率与溶质的结构参数之间的关系。结果发现:(1)流动相流速不同,甲醇浓度相同时,半峰宽与保留时间平方根之间的线性关系的斜率,对四种溶质的范德华体积和范德华表面积作图存在线性关系;(2)随着甲醇浓度的变化,两种作图均收敛趋势,并且计算出了平均收敛点坐标。