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研究目的：G9A是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶,主要催化组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)位点。近年来的研究显示G9A在包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)在内的多种肿瘤中表达异常增高,同时也发现在多种肿瘤细胞中降低G9A的表达或抑制其活性可以抑制肿瘤细胞的增殖,并诱导自噬相关的细胞死亡。HCC是我国高发的恶性肿瘤,其死亡率较高,已成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。但有关G9A与HCC的细胞增殖和自噬的相关性,目前国内外尚无报道。本课题旨在探讨G9A在HCC中的表达及对HCC细胞增殖和自噬的作用,同时为拓宽G9A抑制剂的临床应用提供一种新思路。研究内容和方法：我们首先选择GEO数据库中与肝细胞癌相关的多个公共数据集进行分析,探索G9A在HCC相关组织中的表达差异,以及评价其在HCC预后中的作用。并利用基因集富集分析(GSEA),预测在HCC中可能受G9A调控的基因集,为进一步研究其在HCC发生发展中的作用提供思路。应用Q-PCR技术检测14对HCC患者肿瘤标本和癌旁正常组织中G9A的表达水平；我们以人肝癌细胞系HepG2和Huh7为研究对象,用G9A的特异性抑制剂BIX-01294分别处理两种细胞,观察不同处理时间对G9A表达水平的影响。显微镜下观察细胞形态,CCK8检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期分布和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。随后我们利用免疫荧光技术检测在BIX-01294作用下自噬标志分子LC3B的表达水平,线性回归分析验证G9A与LC3B的相关性,Western blot检测组蛋白甲基化状态、细胞周期蛋白以及自噬相关蛋白的表达水平。克隆形成实验进一步检测G9A对HCC增殖作用的影响,利用免疫缺陷小鼠模型荷瘤后给予不同浓度BIX-01294处理,观察小鼠的成瘤能力及检测肿瘤大小、体积和重量。研究结果：在GEO四种不同的HCC相关的数据集GSE14520(n=488)、GSE6764 (n=75)、GSE14323 (n=124、GSE50579 (n=80)中,证实G9A在HCC肝癌组织中比在癌旁组织、肝硬化、肝脏不典型性增生组织中表达水平增高(对应p值分别为：p<0.001,p<0.001,p<0.001)；在GSE6764数据集中对肝癌不同病程的分析发现,进展期和晚期HCC比极早期HCC的G9A表达水平增高(p<0.01)；HCC临床病理相关性数据分析显示,G9A的表达水平与HCC患者血清AFP水平相关(p<0.01),并推测与患者是否发生肝硬化可能相关；G9A高表达的HCC患者术后易复发,且生存期较短；通过GSEA分析证实高表达G9A的HCC样本富集了与细胞增殖、细胞周期相关的基因集。在细胞实验中发现G9A的抑制剂BIX-01294可以影响组蛋白甲基化,显著抑制细胞增殖,将细胞周期阻滞在G1期。用5μMBIX-01294分别处理Huh7和HepG2细胞株24小时后,发现两种细胞的LC3B的表达水平增高；其中Huh7处理48小时后,LC3BI-降低,而LC3B-II的水平增高,诱发自噬性细胞死亡。线性回归分析证实了G9A和LC3B分子之间存在显著性的线性关系,并且呈负相关(p<0.05,r=-0.172)。通过克隆形成实验发现,G9A活性受BIX-01294抑制后,HCC细胞的克隆形成能力明显下降,进一步表明BIX-01294可以抑制HCC细胞的增殖能力,推测G9A可能通过其介导的组蛋白甲基化参与了HCC细胞增殖的调控过程。在免疫缺陷小鼠模型体内,HCC具有较高的致瘤性,小鼠随机分组后给予G9A抑制剂BIX-01294分别以0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml剂量处理,发现1.0mg/ml组、2.0mg/ml组肿瘤体积、大小及肿瘤重量均显著减小(p<0.05)。同时发现,BIX-01294处理后对HCC荷瘤小鼠的体重没有明显影响。研究结论和意义：本课题发现G9A通过影响肿瘤细胞的增殖、诱发自噬性细胞死亡进而促进肝细胞癌进展。我们的研究表明G9A可以作为临床预后评估的指标及肿瘤治疗的潜在靶点,为G9A抑制剂的进一步临床实验提供了新的依据。