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大量研究证实,人体在没有明显感染或损伤表现时,急性或慢性睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)可导致外周血白细胞计数,C-反应蛋白以及炎症因子水平(IL-1β,IL-6,TNF-α)显著升高。此外,在动物实验研究中发现,睡眠缺乏可引起小鼠海马和大脑皮层小胶质细胞的激活,同时引起局部神经炎症反应,进而加重神经功能损伤。下丘脑是睡眠调节的中枢,但睡眠剥夺对下丘脑小胶质细胞和局部神经炎症的影响及其作用机制尚不明确。组蛋白修饰是在酶的作用下发生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等修饰。常见的组蛋白乙酰化修饰在H3K9(H3N—端第9位赖氨酸)K14、K23等位点。组蛋白乙酰化水平主要由组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和组蛋白乙酰化转移酶(HAT)进行调控。研究发现,组蛋白乙酰化修饰在免疫炎症反应中发挥重要的作用,提高组蛋白乙酰化修饰水平可以减少神经系统的炎性反应;抑制小胶质细胞的活化同时促进小胶质细胞向具有组织修复功能的M2表型转变。但是睡眠剥夺后组蛋白乙酰化修饰在小胶质细胞功能调节中的作用尚未见报道。本实验主要探讨睡眠剥夺对大鼠下丘脑区小胶质细胞的影响和组蛋白乙酰化修饰的改变,观察提高组蛋白乙酰化修饰水平对小胶质细胞活化和相关炎症因子的影响。为临床睡眠障碍患者寻找疾病的理论依据和病因治疗的新方向。第一部分REM期睡眠剥夺后大鼠不同脑区小胶质细胞的表达目的:研究大鼠睡眠剥夺不同脑区小胶质细胞的表达变化。方法:采用改良式多平台水环境法(MMPM)制备SD模型,将30只成年大鼠随机分为:对照组(control,CON)、睡眠剥夺3天组(SD3)、睡眠剥夺6天组(SD6)。免疫荧光法分别观察不同处理组大鼠额叶皮质、海马、下丘脑区的小胶质细胞(Iba-1)的活化情况。结果:免疫荧光染色显示:(1)额叶皮质区:SD3组、SD6组与control组相比,Iba-1活化的数目增多(P<0.05),且细胞胞体增大以及分支变粗;(2)海马区:SD3组、SD6组与control组相比,Iba-1活化的数目增多(P<0.05),且细胞胞体增大以及分支变粗;(3)下丘脑区:SD3组、SD6组与control组相比,Iba-1活化的数目增多(P<0.05),且细胞胞体增大以及分支变粗。结论:睡眠剥夺后额叶皮质、海马、下丘脑小胶质细胞呈活化状态。第二部分大鼠REM期睡眠剥夺后下丘脑组蛋白乙酰化修饰对小胶质细胞的作用目的:探讨REM期睡眠剥夺对组蛋白乙酰化修饰的影响和观察提高组蛋白乙酰化修饰水平对小胶质细胞活化以及相关炎症因子的表达的影响。方法:将大鼠分为5组:control组、SD3组、SD6组、SD3+SAHA(SAHA是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂)组、SD6+SAHA组;应用免疫荧光双标染色法观察正常大鼠下丘脑区小胶质细胞存在组蛋白H3K9位点的乙酰化修饰;应用免疫荧光染色法观察大鼠不同分组下丘脑区小胶质细胞(Iba-1)的活化情况;应用Western Blot检测H3K9乙酰化修饰水平的改变;应用RT-PCR观察下丘脑区TNF-α、IL-6、NOS2、IL-10炎性因子的表达。结果:(1)免疫荧光双标染色显示:正常组大鼠下丘脑区Iba-1中存在组蛋白H3K9位点的乙酰化修饰。(2)免疫荧光染色显示:SD3组、SD6组与control组相比,下丘脑区Iba-1活化的细胞数目增多(P<0.05),且细胞胞体增大以及分支变粗;SD3+SAHA组与SD3组相比,下丘脑区Iba-1活化的细胞数目减少(P<0.05)。SD6+SAHA组与SD6组相比,下丘脑区Iba-1活化的细胞数目减少(P<0.05)。(3)Western Blot显示:SD3组、SD6组与control组相比,下丘脑区H3K9AC水平明显减少(P<0.01);提高组蛋白乙酰化后,下丘脑区H3K9AC的水平明显提高(P<0.05)。(4)RT-PCR结果显示:SD3组、SD6组与control组相比,下丘脑区炎性因子TNF-α、IL-6、NOS2、IL-10 的水平显著提高(P<0.05);SD3+SAHA 组与 SD3 组相比,IL-6、NOS2 表达显著降低(P<0.01),SD6+SAHA 组与 SD6 组相比,TNF-α、IL-6、NOS2表达显著降低(P<0.05),而IL-10表达显著提高(P<0.05)。结论:REM期睡眠剥夺后大鼠下丘脑区小胶质细胞活化,亦可降低组蛋白乙酰化水平,提高组蛋白乙酰化修饰后能够降低睡眠剥夺后小胶质细胞的活化,以及抑制促炎因子表达。提示组蛋白乙酰化修饰可能是调控小胶质细胞活化的重要机制之一。第三部分组蛋白乙酰化修饰抑制炎症反应对睡眠剥夺后大鼠认知功能的影响目的:研究组蛋白乙酰化是否通过抑制炎症反应对睡眠剥夺后大鼠认知功能的影响。方法:将大鼠随机分为3组:CON组、SD6组、SD6+SAHA组。对大鼠在固定时间进行Morris水迷宫测试6天,每天测试后继续睡眠剥夺,第6天观察大鼠穿越原平台次数。结果:SD6组在第4天出现比正常组大鼠潜伏期明显延长(P<0.05);SD6+SAHA组在定位航行第6天比SD6组潜伏期缩短(P<0.05)。在定向航行训练结束后6 h开展的空间探索实验中,SD6组与正常组相比,大鼠在目标象限停留的时间明显减少(P<0.05)。SD6+SAHA组与SD6组相比,组间大鼠在目标象限停留时间无统计学意义(P>0.05)。结论:通过Morris水迷宫实验发现,提高组蛋白乙酰化修饰水平抑制炎症反应,可改善REM期睡眠剥夺后大鼠的认知功能。