论文部分内容阅读
第一部分小白菊内酯对人膀胱癌5637细胞增殖和细胞周期的影响目的研究小白菊内酯(Parthenolide)在体外对人膀胱癌细胞系5637细胞增殖和细胞周期的影响及其可能机制。方法采用MTT法观察不同浓度的小白菊内酯(0,2.5,5.0,7.5和10μM)作用不同时间(24h和48h)后对人膀胱癌细胞系5637细胞增殖的影响。同时应用集落形成试验观察不同浓度的小白菊内酯(0,2.5,5.0,7.5和10μM)对5637细胞集落形成的影响。获取不同浓度小白菊内酯(0,2.5,5.0,7.5和10μM)作用24小时的5637细胞,碘化丙锭(PI)染色后经流式细胞仪检测,并对获取数据进行细胞周期分析。应用Western blotting方法检测与细胞周期调节相关蛋白Cyclin D1和CDK2、p-CDK2、CDK4的表达,来观察小白菊内酯对其表达水平的影响。结果1.小白菊内酯能显著抑制人膀胱癌5637细胞的增殖,并随药物浓度的升高(2.5-10μM)和作用时间的延长(24h-48h),其抑制作用增强,呈明显的浓度和时间依赖性。2.在2.5-10μM浓度的小白菊内酯对人膀胱癌5637细胞作用24h后的抑制率分别为9.5-40%,而在48h后的抑制率分别变为23.9-79%。3.小白菊内酯能显著抑制人膀胱癌5637细胞集落形成,并随着浓度的增高集落形成率逐步下降,在浓度10μM时集落形成抑制率达到87.7%。4.经流式细胞仪检测,不同浓度小白菊内酯(0,2.5,5.0,7.5和10μM)作用人膀胱癌5637细胞24小时后,可以使G1期细胞增多,出现G1期阻滞,并呈剂量依赖性；S期细胞减少；G2/M期细胞与对照组比较无明显变化。5.小白菊内酯(0,2.5,5.0,7.5和10μM)作用人膀胱癌5637细胞24小时后,随着作用浓度的增加,可以使Cyclin D1和p-CDK2减少,并有显著的浓度依赖性。结论小白菊内酯能显著抑制人膀胱癌5637细胞的增殖和集落形成,其抑制作用呈时间和剂量依赖性。小白菊内酯能显著抑制5637细胞中Cyclin Dl和p-CDK2的表达,其可能是诱导5637细胞G0/G1期阻滞的分子机制之一。第二部分小白菊内酯对人膀胱癌5637细胞凋亡的诱导作用目的研究小白菊内酯在体外对人膀胱癌细胞系5637细胞的凋亡诱导作用,并探讨其诱导凋亡的相关分子机制。方法用Hoechst (HO33258)荧光染色法观察经小白菊内酯作用后5637细胞具有的凋亡形态学改变。采用流式细胞仪(PI和annexin V双染法)检测细胞凋亡率的变化。采用Western blotting方法检测不同浓度小白菊内酯(0,2.5,5.0,7.5和10μM)作用48小时后5637细胞中NF-κB信号通路的改变。同时研究了PARP,Bcl-2家族等蛋白在小白菊内酯诱导细胞凋亡中表达水平的变化。结果1.不同浓度小白菊内酯(0,2.5,5.0,7.5和10μM)作用于5637细胞48小时后能明显诱导细胞凋亡,凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。2.荧光显微镜显示不同浓度小白菊内酯(0,2.5,5.0,7.5和101μM)作用于5637细胞48小时后使细胞密度呈剂量依赖性降低。同时观察到凋亡细胞所具有的典型形态学改变。3.通过流式细胞仪(PI和annexin V双染法)检测发现小白菊内酯作用于5637细胞48小时后细胞凋亡呈剂量依赖性增加。小白菊内酯(2.5-10/μM)作用48小时后产生的早期凋亡细胞分别为8.1%-16.5%,晚期凋亡细胞分别为7.0%-70.1%,总的凋亡细胞为15.1%-86.6%。4.小白菊内酯(0-10μM)作用5637细胞48小时后,随着作用浓度的增加,5637细胞PARP被激活,呈显著的浓度依赖性,表现为裂解的PARP片段(89KD)出现。5.小白菊内酯(0-10μM)作用5637细胞48小时后,随着作用浓度的增加,5637细胞中磷酸化IκBα(p-IκBα)的表达逐渐降低,并呈浓度依赖性,但不影响Iκ,Ba的表达。6.小白菊内酯(0-10μM)作用5637细胞48小时后,随着作用浓度的增加,5637细胞中Bcl-2和磷酸化Bad (p-Bad)的表达逐渐降低,呈显著的浓度依赖性。结论小白菊内酯能诱导人膀胱癌细胞系5637细胞凋亡,凋亡的诱导作用呈显著剂量依赖性。小白菊内酯能显著抑制5637细胞中NF-κB信号通路的激活,进而调节Bcl-2家族等蛋白表达变化,并最终诱导凋亡的发生。第三部分小白菊内酯对人膀胱癌5637细胞侵袭转移的影响目的研究小白菊内酯在体外对人膀胱癌细胞系5637细胞迁移侵袭能力的影响及其可能机制。方法利用Transwell小室侵袭和转移实验检测小白菊内酯对5637细胞迁移和侵袭能力的影响。采用RT-PCR方法检测小白菊内酯(0,2.5,5.0,7.5和10μM)作用48小时后的5637细胞中VEGF mRNA、MMP-2mRNA、MMP-9mRNA水平的表达。结果1.小白菊内酯(0-1OgM)作用5637细胞48小时后,随着作用浓度的增加,5637细胞迁移能力明显下降,并呈显著的浓度依赖性。2.小白菊内酯(0-10μM)作用5637细胞48小时后,随着作用浓度的增加,5637细胞侵袭能力明显下降,并呈显著的浓度依赖性。3.小白菊内酯(0-10μM)作用5637细胞48小时后,随着作用浓度的增加,5637细胞的VEGF mRNA、MMP-2mRNA、MMP-9mRNA表达逐渐降低,呈显著的浓度依赖性。结论小白菊内酯能显著抑制人膀胱癌细胞系5637细胞的迁移和侵袭能力。小白菊内酯这种迁移侵袭抑制能力可能与降低VEGF、MMP-2、MMP-9的表达有关。